Добавки з дієтичним ω ‐ 3 пом’якшують зменшення мітохондріального дихання скелетних м’язів, спричинене іммобілізацією, у молодих жінок

Департамент охорони здоров’я людини та харчових наук, Університет Гвельфа, Онтаріо, Канада

Листування: Здоров’я людини та харчові науки, Університет elвельфа, вул. Гордон 491, elвельф, ON N1G 2W1, Канада. Електронна пошта: [email protected]

Кафедра кінезіології Університету Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада

Департамент кінезіології Університету Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада

Департамент охорони здоров’я людини та харчових наук, Університет Гвельфа, Онтаріо, Канада

Кафедра кінезіології Університету Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада

Департамент охорони здоров'я людини та харчування, Університет Гвельфа, Онтаріо, Канада

АНОТАЦІЯ

СКОРОЧЕННЯ

Показано, що порушення використання скелетних м’язів призводить до швидкого зниження м’язової сили, м’язової маси (1–5) та вмісту мітохондрій (6). Хоча молекулярні механізми, що регулюють атрофію м'язів, залишаються недостатньо чітко визначеними, мітохондрії, як видається, є центральними для цих адаптацій, оскільки короткочасне бездіяльність м'язів призводить до зниження експресії мітохондріального білка (7-9), зниження максимального стимульованого дихання аденозиндифосфату (ADP) (8), підвищена схильність до викидів реактивних форм кисню в мітохондріях (АФК) (10) та посилення маркерів окисного стресу (7, 9, 11–13). І навпаки, підвищений вміст мітохондрій в результаті надмірної експресії γ-коактиватора 1α (PGC ‐ 1α), що активується проліфератором пероксисоми, або надання мітохондріального цільового антиоксиданту (18) послаблює атрофію, зумовлену відсутністю використання. Ці дані вказують на те, що втручання, що покращують окислювальний метаболізм мітохондрій або зменшують окисно-відновний стрес, можуть пом'якшити шкідливі наслідки, пов'язані з порушенням роботи м'язів.

Мітохондрії внутрішньо реагують на різні харчові втручання. Показано, що доповнення ω-3 поліненасиченими жирними кислотами змінює склад ліпідів мітохондріальної мембрани скелетних м'язів та покращує чутливість АДФ до мітохондрій незалежно від змін вмісту мітохондрій (19). Це може бути корисним у контексті припинення атрофії, оскільки переміщення АДФ у матрикс мітохондрій та подальше зв'язування АДФ із синтазою аденозинтрифосфату (АТФ) F0F1 стимулює окисне фосфорилювання (оксфос) та зменшує продукцію АФК (20), сигнал, який, як відомо, активує атрофічні шляхи (18). Більше того, спостереження, що ослаблена чутливість АДФ була пов'язана з окислювально-відновним стресом під час старіння (21), і після споживання дієти з високим вмістом жиру (22) додатково підтверджує думку, що реакція мітохондрій на АДФ необхідна для оптимального клітинного здоров'я.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Учасники та біопсія скелетних м’язів

Для дослідження було набрано двадцять здорових середньоактивних жінок, які були рандомізовані на контроль (n = 9) або ω ‐ 3 жирних кислот (n = 11) група добавок. Учасники споживали добавки, що містять соняшникову олію (контроль) або ω ‐ 3 (3 г ейкозапентаенової кислоти; і 2 г докозагексаєнової кислоти щодня) протягом 4 тижнів до і протягом 2 тижнів протоколу іммобілізації однієї ніжки. Це дослідження є частиною більш масштабного розслідування, і всі учасники були порівнянні за віком, зростом, масою, складом тіла та статусом активності, як повідомлялося раніше в McGlory та ін. (28).

Підготовка пермеабілізованих м’язових волокон

Пермеабілізовані м’язові волокна відокремлювали під мікроскопом у буфері BIOPS (50 мМ MES, 7,23 мМ K2EGTA, 2,77 мМ CaK2EGTA, 20 мМ імідазолу, 0,5 мМ DTT, 20 мМ таурину, 5,77 мМ АТФ, 15 мМ PCr та 6,56 мМ MgCl2H2O; pH 7.1). Волокна обробляли 30 мкг/мл сапоніну під час прядіння для проникнення сарколеми і промивали MIR05 (0,5 мМ EGTA, 3 мМ MgCl2‐6H2O, 60 мМ лактобіонату калію, 10 мМ KH2PO4, 20 мМ HEPES, 110 мМ сахарози та 1 г/л BSA без жирних кислот; рН 7,1) або буфер Z [(K ‐ MES (105 мМ), KCL (30 мМ), EGTA (1 мМ), KH2P04 (10 мМ), MgCL2‐6H20 (5 мМ), піруват (0,005 мМ), малат (0,002 мМ), BSA (5 мг/мл)] до аналізу дихання або викидів H2O2.

Мітохондріальне дихання в пермеабілізованих м’язових волокнах

Викид H2O2 у прониклих м’язових волокнах

Мітохондріальне викид H2O2 у прониклі м’язові волокна проводили флуорометрично при 37 ° C у присутності буфера Z, блеббістатину (5 мкМ; MilliporeSigma, Burlington, MA, США), супероксиддисмутази (40 U/мл; MilliporeSigma), амплекс червоного кольору (Thermo Fisher) Scientific, Waltham, MA, USA) та пероксидаза хрону (0,5 ОД/мл; MUliporeSigma). Додавання сукцинату (20 мМ) стимулювало викид H2O2 за наявності або відсутності АДФ (100 мкМ). Експерименти проводились у двох примірниках та усереднювались. Всі волокна сушили, і дані коригували на вагу пучка.

Перетравлення клітковини та вестерн-блот

Статистичний аналіз

Початкове порівняння між контролем та добавкою ω ‐ 3 до іммобілізації визначали за незалежними зразками Стьюдента т тест. Результати в контрольних групах або групах із доповненим ω-3 під час іммобілізації аналізували, використовуючи аналізи ANOVA, що повторювались, у межах дієтичного стану з подальшим проведенням Студент-Ньюман-Кілз post hoc тести, де це доречно. Кінетику Майкеліса-Ментена визначали за допомогою програм Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Статистичну значимість визначали як P сім .

РЕЗУЛЬТАТИ

добавки ω ‐ 3 запобігають зменшенню оксфосу, спричиненому іммобілізацією

За відсутності добавок ω ‐ 3, хоча під час іммобілізації ні дихання, що протікає (відсутність АДФ), ні коефіцієнти дихального контролю не змінювалися, м’язове порушення швидко послаблює дихання, пов’язане з мітохондріями. Зокрема, особи, які отримували контрольну добавку, продемонстрували на 20% зменшення стимульованого АДФ дихання після 3 д іммобілізації, відповідь, яка не посилювалась через 14 д (Рис. 1A). Хоча 3 д було недостатньо для виявлення зменшення мітохондріальних білків оксфосу, 14 д іммобілізації зменшили вміст кількох субодиниць електронно-транспортного ланцюга, незалежно від змін PGC-1α, PGC-1β або АТФ-синтази (рис. 1B). У сукупності ці дані свідчать про іммобілізацію швидко порушеної дихальної здатності мітохондрій.

На відміну від контролю, добавки ω-3 запобігали цьому опосередкованому утилізацією зменшенню оксфосу, як стимульоване АДФ дихання (рис. 1C.) та вміст білка в мітохондріях (рис. 1D) не відрізнялися протягом 14 днів іммобілізації. Враховуючи, що білки динаміки мітохондрій DRP ‐ 1 та MFN ‐ 2 причетні до атрофії м’язового порушення (15), ми далі вивчали, чи різноманітні реакції на вміст мітохондрій будуть пов’язані з ключовими маркерами поділу та злиття. Ми виявили, що хоча контроль та добавки ω-3 не суттєво змінювали експресію білка DRP-1 або MFN-2, співвідношення MFN-2/DRP-1 було нижчим під час іммобілізації під контролем, але не ω-3 (Рис. 2A, B). В цілому ці дані свідчать про те, що споживання ω-3 послаблювало або запобігало зменшенню ємності оксфосу та експресії білка в мітохондріальній динаміці, що зазвичай асоціюється з короткочасною іммобілізацією.

добавки ω ‐ 3 запобігають зменшенню субмаксимальних частот дихання, стимульованих АДФ, спричинених іммобілізацією

Враховуючи, що концентрація АДФ у скелетних м’язах у спокої не насичує, ми далі досліджували субмаксимальне дихання, стимульоване АДФ, та чутливість до АДФ під час іммобілізації. Відповідно до максимальних частот дихання у учасників, які отримували контрольну добавку (рис. 1A), іммобілізація зменшила стимульоване АДФ дихання в діапазоні субмаксимальних концентрацій АДФ через 3 і 14 днів (Рис. 3A). На відміну від цього, учасники, які отримували добавки ω-3, мали подібне субмаксимальне дихання протягом усього іммобілізації (рис. 3B). Ці висновки ω-виправдані, незалежно від змін очікуваного очевидного км для АДФ в будь-якій групі під час іммобілізації (Рис. 4A, B), хоча студентський т Тест показав, що учасники, які отримували добавки ω-3, мали більшу чутливість до АДФ на початку періоду іммобілізації (P

Іммобілізація збільшує вміст антиоксидантного білка незалежно від швидкості викидів H2O2 або перекисного окислення ліпідів після контролю або добавок ω ‐ 3

Оскільки АФК, що походить від мітохондрій, причетна до опосередкованої іммобілізацією втрати м’язів (18) і на неї впливає транспорт ADP у матрикс мітохондрій (20), ми далі вивчали здатність ADP пригнічувати викид H2O2 в мітохондріях. Дивно, але незалежно від дієтичного втручання, іммобілізація не збільшила здатність мітохондріального викиду H2O2 за відсутності або присутності АДФ. Більше того, іммобілізація не послабила здатність АДФ пригнічувати викид мітохондрій H2O2 (Рис. 5A, B). Крім того, 4HNE (тобто., перекисне окислення ліпідів) не було збільшено після іммобілізації, і обидві дієтичні групи виявляли підвищений рівень антиоксидантних ферментів SOD2 та каталази через 14 днів без використання м’язів (Рис. 6A, B). Разом ці дані свідчать про те, що мітохондріальний H2O2 і окислювально-відновний стрес не сприяли різним реакціям, що спостерігаються при іммобілізації після прийому ω ‐ 3.

Іммобілізація не змінила показників ліпідного обміну

Як альтернативне пояснення корисних ефектів добавок ω-3, ми також вивчили маркери ліпідного обміну та кінетику CPT-I після іммобілізації. Споживання добавок ω ‐ 3 не суттєво змінило реакцію різних білків, які беруть участь у метаболізмі ліпідів, оскільки незалежно від дієти ATGL збільшився після 14 днів іммобілізації, тоді як вміст білків, що переносять жир (CD36, FABPpm, FATP4 та CPT‐ I) та маркер мітохондріального ліпідного обміну (β-HAD) не були змінені (Рис. 7A, B). Тільки білок DGAT демонстрував розбіжну реакцію, засновану на добавці, оскільки цей білок збільшувався лише після іммобілізації в контрольному стані (рис. 7C, D). Враховуючи відносно подібні реакції на вміст білка між дієтами, ми дослідили підтримане ліпідами мітохондріальне дихання. У учасників, які отримували контроль або добавки ω ‐ 3, іммобілізація не змінила дихання, підтримуване P-CoA (Рис. 8A, B). Більше того, хоча M-CoA призводив до очікуваного зменшення дихання (P

ОБГОВОРЕННЯ

У цьому дослідженні ми наводимо докази того, що однобічна іммобілізація кінцівок швидко (3 дні) зменшила максимальне та субмаксимальне стимульоване АДФ мітохондріальне дихання. Далі ми демонструємо, що доповнення ω-3 ПНЖК (3 г ейкозапентаенової кислоти; 2 г докозагексаєнової кислоти) запобігало цим мітохондріальним респіраторним реакціям, одночасно надаючи докази того, що посилення викидів H2O2 в мітохондріях та маркерів окисного стресу не спостерігалося під час короткочасного порушення мускулатури. В цілому ці дані кидають виклик підвищенню опосередкованого мітохондріями окислювально-відновного стресу як причини шкідливих наслідків, пов'язаних з простими (тобто., відсутність захворювання (опосередковане захворювання), порушення мускулатури, підкреслюючи потенціал добавок ω ‐ 3 для збереження біоенергетики мітохондріальних м’язів скелетних м’язів.

Іммобілізація та мітохондріальна здатність

Ємність міфохондріального оксфосу була пов’язана з опосередкованою атрофією, пов’язаною з порушенням роботи м’язів, оскільки 7 днів суворого ліжка (6) та 14 днів іммобілізації кінцівок зменшують м’язову масу, м’язову силу та вміст мітохондрій (1). І навпаки, підвищення регуляції вмісту мітохондрій через надмірну експресію PGC ‐ 1α запобігає цим реакціям (14–16). У цьому дослідженні ми наводимо докази того, що дихання мітохондрій у ряді біологічно значущих концентрацій АДФ швидко послаблювалось 3 д іммобілізації кінцівок у групі, яка отримувала доповнення до контролю. Що цікаво, хоча зменшення дихання після 14 днів іммобілізації було пов’язане з втратою білків оксфосу, вони не зменшились через 3 дні, незважаючи на подібне зменшення дихання. Незважаючи на зменшення дихання та білків міфохондріального оксфосу, іммобілізація не змінила вміст білка CPT-I, стимульоване P-CoA дихання або здатність M-CoA пригнічувати дихання, що свідчить про збереження мітохондріальних ліпідних реакцій під час використання. Однак дихання з підтримкою ліпідів становить ∼25% від максимального стимульованого АДФ дихання, і тому навряд чи на нього впливає вміст мітохондрій.

Враховуючи, що мітохондріальна динаміка пов’язана з регулюванням вмісту мітохондрій, а збільшення DRP ‐ 1 пов’язане з деградацією мітохондріального білка під час порушення роботи м’язів (15), нижчий коефіцієнт MFN ‐ 2/DRP ‐ 1 після контролю, але не ω ‐ 3 передбачає більшу активацію процесів ділення під час іммобілізації. Отже, наші дані свідчать про те, що активація мітохондріального обміну білка була розпочата швидко на користь втрати білка; однак, можливо, видалення субодиниць мітохондрій може зайняти більше 3 днів. Крім того, сприятливий вплив добавок ω-3 на білки мітохондріальної динаміки, встановлені в інших дієтичних моделях (29–31), може бути потенційним поясненням підтриманого дихання мітохондрій та експресії білка під час іммобілізації. У сукупності ці дані підкреслюють пластичність і швидке перебудову мітохондрій у зв’язку з порушенням роботи м’язів і вказують, що всього лише 3 ‐ денного відсутності достатньо для зменшення дихальної функції мітохондрій.

Іммобілізація та чутливість АДФ до мітохондрій

Іммобілізація та викид мітохондріального АФК

ВИСНОВКИ

Загалом, ми надаємо нові докази того, що добавки ω ‐ 3 запобігали мітохондріальним розладам після 14 днів іммобілізації. Ми також надаємо уявлення про те, що опосередковане іммобілізацією скорочення міохондріальної біоенергетики швидко впливає на відсутність м’язів (вже через 3 дні), і збільшення окислювально-відновного стресу, опосередкованого мітохондріями, може не знадобитися для зменшення вмісту або функції мітохондрій під час іммобілізації. Паралельно з попереднім звітом цих учасників (28), збережений вміст мітохондрій, функція та метаболізм ліпідів під час іммобілізації можуть сприяти підтримці м’язової маси та сили у відповідь на добавки ω ‐ 3.

ПОДЯКИ

P.M.M. була підтримана випускницькою стипендією Ради природничих наук та технічних досліджень (NSERC) та докторською премією Онтаріо Жіночих наукових праць (OWHSA). СМ. була підтримана науковими стипендіями від Diabetes Canada та Європейського товариства клінічного харчування та метаболізму. Це дослідження фінансувалось НКРЕКП (до G.P.H.) та Канадських інститутів досліджень здоров’я (до S.M.P.). Автори не заявляють конфлікту інтересів.

ВНОСИ АВТОРА

P. M. Miotto та G. P. Holloway розробили цілі дослідження та експерименти для поточного дослідження; C. McGlory та S. M. Phillips розробили випробування щодо іммобілізації; П. М. Міотто проводив експерименти, аналізував дані та готував фігури; C. McGlory, R. Bahniwal та M. Kamal провели випробування щодо іммобілізації; П. М. Міотто та Г. П. Холлоуей склали рукопис; і всі автори відредагували та затвердили остаточну версію рукопису.