Дієтичні тилакоїди із зелених рослин зменшують спорожнення шлунка та транзит кишечника, сприяють змінам мікробної флори кишечника, але не викликають стеатореї

Анотація

Тилакоїди зелених рослин підвищують ситість, впливаючи на такі апетитні гормони, як грелін, холецистокінін (CCK) та глюкагоноподібний пептид-1 (GLP-1). Завданням цього дослідження було дослідити, чи впливають тилакоїди також на шлунково-кишковий тракт та мікробний склад. Для аналізу ефекту на пасаж шлунково-кишкового тракту 16 щурів годували контрольною або дієтою з високим вмістом жиру (HFD), що отримувала тилакоїди, за 30 хв до прийому синього Еванса. Ще 16 щурів годували контрольним HFD або тилакоїдним HFD протягом двох тижнів до внутрішньошлункового зараження синім Evans. Кількість синього кольору Еванса в шлунку та відстань міграції в кишечнику через 30 хв використовувались як вимірювання спорожнення шлунка та кишкового транзиту. Вони були зменшені за рахунок прийому тилакоїдів у гострому дослідженні, але не суттєво також після двотижневого дослідження дієти.

Другою метою дослідження було дослідити, чи впливає добавка тилакоїдів на мікробіоти кишечника та кількість фекального жиру у здорових добровольців (n = 34) лікування тилакоїдами або плацебо протягом трьох місяців. Мікробіоти аналізували за допомогою секвенування генів 16S рРНК та qPCR, а фекальний жир екстрагували дихлорметаном. Загальна кількість бактерій, зокрема Fragilis бактеріод групи, збільшили лікування тилакоїдами порівняно з плацебо, тоді як тилакоїди не викликали стеатореї. Таким чином, дієтичні добавки з тилакоїдами впливають на ситість як через гормони апетиту, так і на повноту шлунково-кишкового тракту, а також впливають на мікробний склад, не викликаючи негативних наслідків для ШКТ, таких як стеаторея. Це говорить про тилакоїди як про новий засіб для профілактики та лікування ожиріння.

Передумови

Тилакоїди є частиною хлоропласту у всіх зелених листках, оскільки вони є місцями для фотосинтезу. Тилакоїди складаються з різних зв’язаних з мембраною білків, галактоліпідів, фосфоліпідів та антиоксидантів, таких як хлорофіл, каротиноїди, зеаксантин та лютеїн [6]. Раніше було виявлено, що тилакоїди, витягнуті зі шпинату, подовжують ліполіз [7], зменшують поглинання глюкози над стінками кишечника та створюють додатковий тимчасовий шар, що покриває слизову сторону кишечника [8]. У дослідженнях на тваринах добавки тилакоїдів призводять до зменшення кількості жиру в організмі [9] та зменшення споживання їжі [10, 11]. В дослідженнях людського втручання було показано, що тилакоїди сприяють ситості, впливаючи на суб’єктивну повноту, голод і потяг до певної їжі, а також посилюють вивільнення пригнічуючих апетит гормонів холецистокініну (CCK), глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP -1) і лептину, а також для придушення гормону голоду греліном [12–16]. Також повідомлялося про вплив на гомеостаз глюкози та інсуліну після стандартизованого прийому їжі, а також на стан голодування [12, 13, 15]. Більше того, добавки до тилакоїдів сприяють зниженню маси тіла у людей; 6,3% за три місяці [12].

Метою цього дослідження було дослідити, як добавки тилакоїдів впливають на спорожнення шлунка, кишковий транзит та плазмові концентрації CCK, використовуючи дві моделі щурів; одна - вимірювання негайних наслідків дієти з високим вмістом жиру тилакоїдами шляхом вимірювання, а друга - вимірювання ефекту після двотижневої добавки тилакоїдів у дієті. Другою метою було вимірювання змін мікробного складу в калі, а також кількості фекального жиру після тримісячного щоденного прийому тилакоїдів у жінок із зайвою вагою.

Методи

Експерименти на тваринах

Гостре дослідження; HFD через датчик

Двотижневе споживання їжі за бажанням

У двотижневому дослідженні лікування щурів розділили на дві групи; один, який отримує вільний доступ до HFD тилакоїдів (n = 8) і один, що отримує вільний доступ для контролю HFD (n = 8) протягом 2 тижнів. В останню добу щурів злегка знеболили флуотаном, а внутрішньошлункову болюсну дозу Еванс-синього давали дахою. Через тридцять хвилин щурів глибоко знеболювали і проводили ту саму процедуру, що описана для гострого дослідження.

Аналіз спорожнення шлунка та кишкового транзиту

Зразки кишечника та шлунку центрифугували при 3000 × g протягом 30 хв при 4 ° C, після чого 1 мл кожного зразка переносили в пробірки Еппендорфа та центрифугували при 16000 × g протягом 60 хв при 4 ° C. Нарешті 100 мкл кожного зразка завантажували на 96-лункову платівку та зчитували поглинання при довжині хвилі 565 нм (A565). Відсотки спорожнення шлунку та міграції Еванса були розраховані за допомогою рівнянь 1 та 2 [19].

Рівняння 1. Відсоток спорожнення шлунка розраховували за формулою:

Рівняння 2. Відсоток міграції Еванса розраховували за формулою:

Людський експеримент

Зразки фекалій були зібрані у 34 жінок із надмірною вагою (n = 18 у групі тилакоїдів, n = 16 у контрольній групі), які брали участь у 12-тижневому дослідженні дієти та лікування, описане раніше [12]. Чорничний напій, з добавками тилакоїдів або без них, вживали щоранку протягом 12 тижнів. Чорничний напій містив 50 мл чорничного супу (Ekströms original, Procordia Food AB, Eslöv, Швеція) та 2,8 г ріпакової олії (Zeta, Di Luca & Di Luca AB, Стокгольм, Швеція). У тилакоїдний чорничний напій було додано 5 г апетилу (Greenleaf Medical, Стокгольм, Швеція). Калорійність становила 209 кДж/50 ккал у тилакоїдному напої та 188 кДж/45 ккал у контрольному напої. Критеріями виключення були цукровий діабет, харчова алергія та непереносимість, синдром роздратованого кишечника, недавнє вживання антибіотиків (протягом шести місяців з моменту включення), а також наявність вегетаріанця, курця, вагітності або перебування на дієті для схуднення протягом останніх трьох місяців.

Протягом 12-тижневого періоду втручання випробовуваним було наказано споживати три прийоми їжі на день і не перекушувати між прийомами їжі, а також виконувати 30 хв інтенсивних фізичних вправ з низьким та середнім значенням щодня. Протягом 12-тижневого втручання у всіх суб'єктів зменшилась маса тіла, а група тилакоїдів значно зменшилась у вазі тіла та в рівні ліпідів у крові. Більш детально описуючи випробування на людях та результати можна знайти в попередньому дослідженні [12].

У цьому дослідженні було включено лише 34 із первинних 36 жінок через невідповідність здачі зразків фекалій. Експеримент проводився відповідно до керівних принципів, викладених у Гельсінській декларації, і всі процедури, що стосуються людей, були затверджені Комітетом з етики університету Лунда (№ 2006/361). Письмова та усна поінформована згода була отримана від усіх учасників до початку експерименту.

Зразки фекалій були зібрані учасниками у їхньому домашньому середовищі протягом двох днів до прибуття до клініки та поміщені до -20 ° C безпосередньо після забору. Учасники отримали стерильні пробірки об’ємом 50 мл із маленькою ложкою, прикріпленою до кришки, спеціально розроблену для цієї мети. У клініці зібрані зразки розморозили і розділили надвоє; одну частину витримували при -80 ° C до проведення бактеріальних аналізів, а іншу частину поміщали у відкриту скляну ємність і залишали сушитися при 100 ° C протягом 48 годин до проведення аналізу вмісту жиру.

Аналіз вмісту жиру

Сухий фекальний матеріал (

Аналіз мікробіоти

ДНК-екстракція

ДНК із зразків фекалій виділяли та очищали за допомогою набору тканин EZ1 DNA Tissue Kit та роботи-машини EZ1 Advanced XL (картка бактерій; Qiagen, Hilden, Німеччина), як описано раніше [19]. Для подальшого руйнування стінок бактеріальних клітин перед екстракцією в EZ1 Advanced XL був доданий етап збивання кульки протягом 45 хв при 4 ° C. Екстраговану ДНК зберігали в 1x TE-буфері при 4 ° C до подальших аналізів.

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Тилакоїди

Тилакоїди (Апетильний®), використані в дослідженнях, були надані компанією Greenleaf Medical AB (Стокгольм, Швеція). Вилучення тилакоїдів, в даному випадку з листя шпинату, було описано раніше [9], з тією різницею, що цей порошок був отриманий після сушіння в барабані. Тилакоїди, однак, можна отримати з усіх зелених листків. 100 г порошку тилакоїдів містять 41,7 г вуглеводів (з них 38,7 г нерозчинної клітковини), 23,5 г білка і 11,9 г жиру.

Біохімічні аналізи

Концентрацію CCK у плазмі крові вимірювали лише у дослідженні гострого щура, у зразках крові, взятих через 30 хв після болюсної дози орогастрального шлунку Evans blue. CCK вимірювали за допомогою RIA з високоспецифічною антисироваткою (92128, межа виявлення 0,1 пмоль/л) згідно з описаним раніше методом [20].

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз даних проводили за допомогою Prism, версія 6 (GraphPad software Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Щодо експериментів на щурах, дані контролювали на нормальність за допомогою тестів Шапіро-Вілька та КС на нормальність і проходили нормальність для всіх випадків, крім гострого відсотка міграції Еванса. Тому Манн Вітні т-для цього розрахунку використовувався спеціально тест, тоді як Студенти т-тест використовувався для решти розрахунків щодо експерименту на щурах. Крім того, описові дані для людей та кількість вмісту жиру у фекаліях пройшли нормальні розрахунки, а статистичні відмінності оцінювали з парними студентами т-тест у кожній групі лікування. Для мікробіоти статистичні оцінки проводились із використанням непараметричних повторних вимірювань тесту Вількоксона. Значення P ≤ 0,05 вважали суттєво різними.

Результати

Вплив тилакоїдів на спорожнення шлунка та кишковий транзит

Щури, яких лікували тилакоїдами, як гостро, так і в якості харчової добавки протягом двох тижнів, демонстрували зменшення спорожнення шлунка та часу кишкового транзиту порівняно з контрольними щурами (рис. 1а-b (GE)). Випорожнення шлунка зменшилось на 41% у гострому експерименті з тилакоїдами (P = 0,02) і на 34% у двотижневому дослідженні добавок до тилакоїдів (P = 0,08, незначно), порівняно з умовами контролю.

Шлунково-кишковий транзит, виміряний як відстань, яку синій Еванс мігрував по кишковому тракту протягом 30 хв, також був зменшений за рахунок прийому тилакоїдів, проте не суттєво (рис. 1 c-d (Mi)). Міграція зменшилася після прийому тилакоїдів як в гострому експерименті з тилакоїдами (P = 0,08) і після двотижневого дослідження добавок тилакоїдів (P = 0,05). Добавки тилакоїдів не впливали на концентрацію CCK у плазмі крові (P = 0,62) після болюсних доз, наведених у гострому дослідженні (рис. 2). Концентрації в плазмі не вимірювали у двотижневому дослідженні добавок до дієти, оскільки CCK вивільняється у відповідь на поживні речовини, і в цьому дослідженні ми не контролювали, коли щури споживали їжу.

Вплив на концентрацію CCK у плазмі крові 60 хв після болюсної дози тилакоїду, доповненого HFD, порівняно з контрольним HFD (контроль n = 6, тилакоїд n = 8 щурів). Стовпчики представляють середнє значення + SEM. Статистичної різниці між тилакоїдами та контрольованими щурами не спостерігалося

Шлунково-кишкові ефекти щоденних добавок тилакоїдів протягом трьох місяців

Вміст жиру у зразках фекалій людини не змінювався порівняно з вживанням дієти ні в тилакоїдах, ні в контрольних групах (рис. 3). Однак додавання тилакоїдів впливало на кількість та склад мікробної флори кишечника. Кількісна оцінка бактерій у зразках фекалій людини показала значне збільшення загальної кількості копій гена 16S рРНК після споживання тилакоїдів протягом трьох місяців порівняно з періодом до втручання (P = 0,03). Крім того, у групі тилакоїдів кількість генів 16S рРНК, специфічних для B. fragilis група була значно вищою після (P = 0,002), порівняно з попереднім втручанням, тоді як для контрольної групи значущих відмінностей не виявлено (табл. 2). Не виявлено суттєвих відмінностей ні в тилакоїдах, ні в контрольних групах щодо кількості копій гена 16S рРНК A. muciniphilia-як бактерії, C. кокоїди групи, C. leptum підгрупа, Enterobacteriaceae або Лактобактерії у кінцевій точці порівняно з вихідним (Таблиця 2).

Вміст жиру у зразках фекалій, отриманих у жінок із надмірною вагою до і після тримісячного періоду дієтичного вживання тилакоїдів (n = 17) або плацебо (n = 16). Жодної суттєвої різниці між дослідженнями до та після дослідження не виявлено в жодній з груп. Стовпчики представляють середнє значення + SEM

Обговорення

Це дослідження демонструє, що додавання тилекоїдів до дієти зменшує спорожнення шлунка та час проходження кишечника, а також виявляє незначний вплив на кількість та склад мікробіоти кишечника. Більше того, вміст жиру у фекаліях не впливав на добавки тилакоїдів протягом трьох місяців.

Раніше було показано, що прийом тилакоїдів протягом більш тривалого періоду часу зменшує масу тіла людини [12], а також зменшує приріст маси тіла та кількість жирової маси у гризунів [9, 10]. Встановлено також, що тилакоїди впливають на суб’єктивні оцінки бажань і смаків до їжі, а також на рівень голоду, ситості та тяги до смачної їжі [12–15, 23], що все можна пояснити впливом на регулювання апетиту. гормони, згадані вище. Описаний тут фізіологічний ефект зниженого спорожнення шлунка разом із підвищеною секрецією гормонів, таких як GLP-1 та CCK, призведе до посилення почуття ситості. Це, в свою чергу, може зменшити споживання їжі і тим самим сприяти втраті ваги тіла [27–29]. Це дослідження, що демонструє зниження спорожнення шлунку та транзиту кишечника після прийому тилакоїдів, проте не в значній мірі, пропонує нове механістичне пояснення результатів, отриманих раніше в області досліджень тилакоїдної апетиту.

Зразки фекалій людини, відібрані до і після тилакоїдів або контрольних дієтичних добавок протягом трьох місяців, показали, що добавки тилакоїдів не впливають на загальну кишкову абсорбцію ліпідів у їжі. Оскільки тилакоїди мають спорідненість як до комплексу ліпази/коліпази, так і до тригліцеридів [7, 30], обговорювалося, чи можуть тилакоїди мати такі ж побічні ефекти з боку шлунково-кишкового тракту, як стеаторея, як це було показано після лікування орлістатом [5]. Раніше було показано, що кількість фекального жиру не впливає на щурів, які отримували HFD з добавками тилакоїдів або без них протягом 10 днів [22]. Однак це дослідження є першим дослідженням, що вивчає вміст жиру у фекаліях після тривалого прийому тилакоїдів у людей. Результати цього дослідження, не демонструючи відмінностей у кількості фекального жиру між тилакоїдами та контролем, підтверджують результати попередніх досліджень, які показують, що тилакоїди оборотно пригнічують активність ліпази [7, 22, 30, 31]. Отже, ми можемо з упевненістю сказати, що лікування тилакоїдами не викликає побічних ефектів з боку шлунково-кишкового тракту, таких як стеаторея, які є загальними для інших інгібіторів ліпази [5].

Під час тримісячного втручання людини, опублікованого раніше в Appetite, усі випробовувані зменшили свою масу тіла. Однак у цьому дослідженні охоплено лише 34 жінки з початкових 36, які були залучені до попереднього дослідження [12]. Відмінності, виявлені в мікробіоти кишечника між тилакоїдами та контрольною групою, можуть бути спричинені зміною маси тіла, але оскільки попереднє дослідження також показало зміни в регулюючих апетит гормонах, ми вважаємо, що все навпаки, оскільки зміна в кишечнику Показано, що мікробіота призводить до посиленої секреції SCFA, PYY та GLP-1 внаслідок ферментації товстої кишки [2, 32]. Попередні дослідження, що описували ефекти тилакоїдів, показали зменшення кількості холестерину, підвищену секрецію гормонів ситості та значну втрату ваги [12, 13]. Таким чином, ми пропонуємо також, щоб мікробіота кишечника підтверджувала механістичні пояснення цих результатів.

Висновок

На закінчення, це дослідження описує зменшення спорожнення шлунку та часу транзиту кишечника після прийому тилакоїдів щурами. Незважаючи на те, що всі результати не є суттєво доведеними, результати додають механістичного пояснення раніше відміченим змінам регулюючих апетит гормонів після прийому тилакоїдів. Чи залишається затримкою спорожнення шлунка причиною чи наслідком зниження рівня пептидів, що впливають на голод, і підвищеного рівня пептидів, що впливає на ситість та винагороду в попередніх дослідженнях, залишається без відповіді. Більше того, результати показують, що споживання тилакоїдів не викликає стеатореї, а споживання тилакоїдів сприяє незначним змінам мікробіоти кишечника. Незначна зміна мікробного складу може бути спричинена втратою ваги, але ми вважаємо, що втрата ваги є наслідком зміни мікрофлори у поєднанні зі зміною регулюючих апетит гормонів, як було показано в попередніх дослідженнях. Разом із попередніми ефектами споживання тилакоїдів, ми пропонуємо тилакоїди як перспективну натуральну добавку для контролю ваги без будь-яких відомих побічних ефектів, що впливає на травлення, обмін речовин і веде до здорових харчових звичок.