Дефіцит вітаміну А знищує карциному легені Льюїса через індукцію вроджених лімфоїдних клітин 2 типу та активує макрофаги

Департамент харчування та гігієни продуктів харчування, Школа громадського здоров'я, Університет Цзілінь, Чанчунь, Китай

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Шукайте більше статей цього автора

Кафедра патології, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Шукайте більше статей цього автора

Кафедра педіатрії приєднаної лікарні Чанчунського університету китайської медицини, Чанчунь, Китай

Відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Департамент епідеміології та біостатистики Школи громадського здоров'я Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Відділення гепатології, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Кафедра торакальної хірургії, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Листування

Пен Чжан, відділ торакальної хірургії, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Донг Лі, відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Відділення гепатології, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Кафедра патології Кембриджського університету, Кембридж, Великобританія

Листування

Пен Чжан, відділ торакальної хірургії, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Донг Лі, відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Департамент харчування та гігієни продуктів харчування, Школа громадського здоров'я, Університет Цзілінь, Чанчунь, Китай

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Шукайте більше статей цього автора

Кафедра патології, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Шукайте більше статей цього автора

Кафедра педіатрії приєднаної лікарні Чанчунського університету китайської медицини, Чанчунь, Китай

Відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Департамент епідеміології та біостатистики Школи громадського здоров'я Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Відділення гепатології, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Кафедра торакальної хірургії, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Листування

Пен Чжан, відділ торакальної хірургії, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Донг Лі, відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Відділення гепатології, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай

Кафедра патології Кембриджського університету, Кембридж, Великобританія

Листування

Пен Чжан, відділ торакальної хірургії, Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Донг Лі, відділ імунології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

Анотація

Передумови

Карцинома легенів все ще пов'язана з високими показниками захворюваності та смертності, незважаючи на досягнення в терапії раку, досягнуті за останні десятиліття. Недавні дослідження показали, що імунні відповіді відігравали вирішальну роль у розвитку раку, включаючи рак легенів. Імунна відповідь типу 1 може сприяти розвитку класичних активованих макрофагів (САМ) з протипухлинними властивостями. На відміну від цього, імунна відповідь типу 2 може призвести до поляризації альтернативно активованих макрофагів (ААМ), що може сприяти росту та метастазуванню пухлини. Наші попередні дослідження показали, що дефіцит вітаміну А може сприяти імунної відповіді типу 2, але не імунної відповіді типу 1. Чи потребує дефіцит вітаміну А згубний вплив на карциному легенів, потрібно додатково дослідити.

Дослідити вплив дефіциту вітаміну А на рак легенів та потенційні механізми.

Методи

Мишей годували нормальним харчуванням або дієтою з дефіцитом вітаміну А протягом 2 тижнів, а потім клітини раку легенів Льюїса (LLC), розчинені в Matrigel Matrix, висаджували на ліву нижню частину легенів. Мишей жертвували через 28 днів після плантації пухлинних клітин, вимірювали розмір пухлини, профіль цитокінів у рідині бронхоальвеолярного промивання (BALF), кількість вроджених лімфоїдних клітин типу 2 (ILC2) та фенотипи макрофагів у легенях. Під час експериментів також контролювали загальну виживаність.

Результати

Дієта з дефіцитом вітаміну А, що годується мишами, що несуть пухлини, має нижчий рівень виживання (χ 2 = 6,862, стор

Висновок

Дефіцит вітаміну А може сприяти розвитку патогенезу карциноми легенів через індукцію ILC2 і поляризаційні AAM.

1. ВСТУП

Карцинома легенів як і раніше є однією з провідних причин смертності в Китаї, незважаючи на досягнення, досягнуті в останні десятиліття (Chen et al., 2016). Точна етіологія карциноми легенів досі ще не до кінця зрозуміла, але, як правило, вважалося, що вона пов'язана як з генетичними, так і з факторами навколишнього середовища (Cheng et al., 2012). Недавні дослідження про взаємодію імунної системи та пухлин, включаючи рак легенів, показали, що доля пухлин або навіть господаря визначатиметься імунною системою, яка інфільтрувала та оточувала пухлини (Joyce & Fearon, 2015; Kitamura, Qian, & Pollard, 2015; Лим & червень, 2017). Імунні клітини можуть або усунути пухлини, або сприяти росту та метастазуванню пухлини, що навіть може призвести до смерті господаря. Відродження імунотерапії пухлин в останнє десятиліття довело, що можна лікувати пухлини, маніпулюючи імунною системою (Bender, 2017; Couzin-Frankel, 2013). Хоча багато сучасних досліджень було зосереджено на цитотоксичних Т-лімфоцитах, як і робота над блокуванням PD-1/PDL-1 і CTLA-4 (Pardoll, 2012), існують інші імунні клітини, які можуть регулювати імунну систему і навіть вбивати пухлинні клітини безпосередньо, як найважливіші імунні клітини, макрофаги (Mantovani, Marchesi, Malesci, Laghi, & Allavena, 2017).

Макрофаги відіграють важливу роль на всіх етапах імунної відповіді; він може ініціювати, підтримувати або припиняти імунні відповіді (Wynn, Chawla, & Pollard, 2013). Традиційно макрофаги можуть бути віднесені до двох окремих підмножин, одна - це протизапальний M1 або класично активуються макрофаги (CAM), які можуть поляризуватися цитокінами типу I, такими як IL-12 та INFγ; інший - протизапальний, з роздільною здатністю та профібротичний М2 або поперемінно активує макрофаги (ААМ), які можуть поляризуватися цитокінами типу II, такими як IL-4, IL-5 та IL-13 (Wynn et al., 2013; Wynn & Vannella, 2016). І САМ, і ААМ незамінні для підтримки балансу імунної системи. Імунній системі потрібні CAM для їх протиінфекційних або протипухлинних властивостей для захисту, а AAM для обмеження імунної відповіді, щоб уникнути пошкодження самоклітин (Hume, 2015; Vannella & Wynn, 2017). Макрофаги також можуть зіграти визначальну роль у формуванні імунної відповіді під час патогенезу пухлин. Вони можуть мати як згубні, так і сприятливі наслідки, що залежать від конкретних умов поляризації (Murray, 2017). Повідомлялося, що CAMs можуть придушувати ріст пухлин, проте AAMs, як повідомляється, можуть сприяти росту та метастазуванню пухлин (Mantovani et al., 2017).

У цій роботі ми встановили модель карциноми легенів Льюїса шляхом посадки клітин LLC прямо на ліву нижню частину легенів мишей C57/B6. І ми порівняли ріст пухлини та показник виживання мишей, які отримували дієту з дефіцитом вітаміну А (VAD) або контрольну дієту, отриману клітинами LLC або контролем гелю матриці. Ми також вимірюємо цитокінові профілі BALF, вроджені лімфоїдні клітини типу 2 (ILC2) та макрофаги цих мишей, щоб дослідити роль вітаміну А в карциномі легенів.

2 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

2.1 Миші

Миші-самці C56BL/6 без конкретних патогенів вагою 20–22 г (придбані у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Пекін, Китай) утримувались в умовах, що не містять патогенів, в Університеті Цзілінь, Китай. Всі експерименти проводились відповідно до Національних настанов щодо експериментального добробуту тварин та за схваленням Комітету з питань добробуту тварин та дослідницької етики в Університеті Цзілінь (Cui et al., 2016; Li et al., 2016).

Дієти, достатні вітаміну А (TD.10992) та дефіциту вітаміну А (TD.10991), були придбані у Harlan Laboratories, Inc., WI, США (Cui et al., 2016; Spencer et al., 2014). Всім мишам дотримувались спеціальної дієти та автоклавної дистильованої води з дня прибуття до кінця експериментів, а всі інші процедури починали, принаймні, через 14 днів після цього, відповідно.

2.2 Аналіз імуноферментного зв’язку

Концентрації цитокінів у рідині BAL визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ELISA, eBioscience, Inc., CA, USA) відповідно до інструкцій виробників, як описано раніше (Cui et al., 2016; Li et al., 2016; Li, Guabiraba, et al., 2014; Pushparaj et al., 2013).

2.3 Модель карциноми легенів Льюїса

Модель раку легенів Льюїса була встановлена, як описано (Bobek et al., 2010). Коротко, клітини LLC культивували в повноцінних середовищах (DMEM з 10% інактивованою тепловою енергією FBS, 100 ОД/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 2 мМ L-глютаміну; Sigma-Aldrich, MO, США). Культури інкубували при температурі 37,0 ° C у зволоженому інкубаторі (Thremo Fishher, Німеччина) з додаванням 5% CO2. Живучі клітини підраховували гемоцитометром Нойбауера на мікроскопі Nikon Labphot, фарбуючи 0,1% (мас./Об.) Трипановим синім (Sigma-Aldrich, MO, США).

Мишей знеболювали внутрішньочеревно (внутрішньовенно) ін'єкціями 150 мкл авертину (20 мг/мл 2,2,2 ‐ триброметанолу, Sigma-Aldrich, MO, США). Потім легені оголювали хірургічно розкритим довжиною біля лінії грудної клітки довжиною близько 0,5 см, клітинами 6 × 10 5 LLC, суспендованими в 20 мкл BD Matrigel (Becton Dickinson, NJ, США), або ін’єкцією Matrigel (для контрольних груп) на лівій нижній частині легенів. Хірургічні рани зашивали швом. І за мишами ретельно стежили, поки повністю не вийшли з наркозу. Мишей жертвували через 28 днів після ін’єкції клітин LLC шляхом i.p. ін'єкція 500 мкл авертину. Тканини рідини та легеневих тканин бронхоальвеолярного лаважу (BAL) збирали та аналізували, як описано раніше (Cui et al., 2016; Li, Guabiraba, et al., 2014). Розмір пухлини розраховували за наступною формулою, V = 0,5 × L × W 2, де L і W - довжина та ширина пухлини (Li, Tian та ін., 2014).

2.4 Кількісна ПЛР

РНК очищали від зразків тканин за допомогою RNeasy Mini Kit, дотримуючись інструкцій виробника, як було описано раніше (Qiagen, Великобританія; Cui та ін., 2016; Li, Guabiraba та ін., 2014). Зворотну транскрипцію (RT) РНК в кДНК проводили за допомогою наборів зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Thermo Fisher Scientific, MA, США). Ланцюгова реакція полімеразного режиму в реальному часі (RT-PCR) проводилася за допомогою магістральної суміші Fast SYBR Green на Prism 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Були використані такі праймери: Іл4, вперед 5′ ‐ CAT GGC TTG GGT ACA GGT CT ‐ 3 ′, задній 5′ ‐ TTT GTA GTG GGA GGG GAC AG ‐ 3 ′; Іл5, вперед 5′ ‐ GAA GTG TGG CGA GGA GAG AC ‐ 3 ′, задній 5′ ‐ GCA CAG TTT TGT GGG GTT TT ‐ 3 ′; Il13, вперед 5′ ‐ GAA TCC AGG GCT ACA CAG AAC ‐ 3 ′, задній 5′ ‐ AAC ATC ACA CAA GAC CAG ACT C ‐ 3 ′; Іфнг, вперед 5′ ‐ ACT TTG CTT CTG CCT TTC CA ‐ 3 ′, задній 5′ ‐ ACA AGG TCA CCC ACA GGA ‐ 3 ′.

2.5 Комп’ютерне томографічне сканування

Мишей утримували в умовах, вільних від патогенів, протягом 21 дня після введення ТОВ; розвиток раку легенів визначали за допомогою комп’ютерної томографії (КТ). Сканування проводили за допомогою КТ-сканера (SOMATOM Definition AS, Siemens Healthcare GmbH, Німеччина), як описано раніше. Мишей знеболювали і поміщали в лежаче положення на ліжку мікро-КТ без дихальних затворів. Напруга в трубці становила 120 кВ, струм - 35 мА, а час витримки - 5 с.

2.6 Проточна цитометрія

Лейкоцити, просочені в легені, аналізували за допомогою проточної цитометрії, як описано раніше (Li, Guabiraba та ін., 2014). Коротко кажучи, легені збирали на 14-й день після введення ТОВ та перетравлювали у 125 мг/мл ліберази TL та 100 мг/мл ДНКази 1 (Roche Diagnostics, Швейцарія) для характеристики лейкоцитів, що проникають. Дисперговані клітини (1 × 10 6 клітин на пробірку) фарбували кон'югованими флуорохромом mAb проти CD45-PerCP, CD11b-APC (усі антитіла, що використовуються в проточній цитометрії, були придбані у BD, NJ, США. Якщо не вказано інше), F4/80 ‐FITC (eBioscience, Каліфорнія, США) та CD206-PE (BioLegend, Каліфорнія, США). Лейкоцити фарбували антитілами проти ST2 – FITC (MD Biosciences, MN, США), маркерами лінії (CD3, B220, CD11b, CD11c, FcεR1, SIGLEC-F), міченими PE, CD45 ‐ APC та ICOS ‐ PerCP (BioLegend) для характеристики інфільтруючих ILC2. Клітини аналізували за допомогою BD Carlibr Analyzer (BD). Стратегія воріт (супровідна інформація Малюнок S1) та аналіз проводились за допомогою програмного забезпечення FlowJo (FlowJo LLC OR, США).

2.7 Статистичний аналіз

Аналіз між групами in vivo досліджував Манн – Уїтні U тест або ANOVA з наступним студентським т тест за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (Cui et al., 2016; Li et al., 2016; Li, Guabiraba, et al., 2014). Аналіз виживання стор значення розраховували за допомогою тесту log-rank (Mantel – Cox). Усі дані виражаються як середні значення ± SEM. Значення стор

3 РЕЗУЛЬТАТИ

3.1 Дефіцит вітаміну А посилює ріст клітин пухлини

Наше попереднє дослідження показало, що дефіцит вітаміну А (VAD) може посилити імунну відповідь типу II та посилити прогресування захворювань на моделі астматичних мишей (Cui et al., 2016). Щоб дослідити, чи можна спостерігати подібні явища в пухлині, ми годували мишей VAD або контрольною дієтою протягом двох тижнів перед введенням пухлинних клітин. Миші в групі VAD мали значно нижчий рівень виживання в порівнянні зі звичайною дієтичною групою після отримання пухлинних клітин (χ 2 = 6,862, стор

дефіцит

3.2 Дефіцит вітаміну А посилює проникнення імунних клітин до легенів

Після встановлення, що годування дієтою VAD може посилити рак легенів у мишей. Далі ми досліджуємо, як ВАД може впливати на рекрутування імунних клітин у легенях. BALF збирали після того, як мишей припиняли, і клітини в BALF аналізували. Загальна кількість комірок була збільшена на VAD (т = 13,43, стор 0,05; т = 2,190, стор > 0,05; т = 1,236, стор > 0,05; Малюнок 2b, c, e).

3.3 Дефіцит вітаміну А підвищує рівень цитокінів II типу в легенях

Після встановлення, що ВАД посилює ріст пухлини та інфільтрацію імунних клітин у легені. Далі ми перевіряємо профілі цитокінів у BALF, лише цитокіни типу II, такі як IL-4, IL-5 та IL-13, регулювались VAD (т = 2,332, стор 0,05; Малюнок 3в). Також аналізували експресію генів цих цитокінів у легеневій тканині. Дуже схожий на аналіз білка, вирази Іл4, Іл5, і Il13 (т = 2,543, стор 0,05; Малюнок 3e – h).

3.4 Дефіцит вітаміну А посилив інфільтрацію ILC2 і AAM у легені

Потім клітини легеневої тканини аналізували за допомогою проточної цитометрії, щоб дослідити, як ВАД впливає на рак легенів. ILC2 були набрані в легені VAD (т = 7.680, стор 2014). Кількість макрофагів у легенях також підвищувалась за допомогою VAD (т = 5,294, стор

4 ОБГОВОРЕННЯ

У цьому дослідженні ми виявили, що VAD може збільшити інфільтрацію ILC2 в легені, що може бути пов'язано з посиленою продукцією цитокінів II типу в легені, в свою чергу може збільшити поперемінно активовані макрофаги в легені, що врешті-решт призведе до загострення росту пухлини і зниження рівня виживання мишей, що несуть пухлини.

Добре встановлено, що взаємодія між пухлинними клітинами та імунними клітинами може визначати остаточну долю пухлини (Mantovani et al., 2017). Це може бути усунене імунними клітинами або допомогти імунним клітинам неконтрольовано рости або метастазувати в інші органи (Lim & June, 2017). Незважаючи на те, що в ці процеси залучається багато факторів, макрофаги, які, як було відомо, мають плейотропні функції, можуть тут відігравати домінуючу роль (Wynn & Vannella, 2016). Інфільтруючий пухлина або навколишні макрофаги можуть вбивати пухлинні клітини прямо або опосередковано шляхом вербування, активації та поляризації інших імунних клітин, або вони можуть допомогти клітинам пухлини вирватися з інших імунних клітин, залежно від того, в які підгрупи макрофагів поляризовано (Brune et al ., 2015). Подальше розуміння того, як поляризували макрофаги, може допомогти змінити статус поляризації макрофагів та допоможе в лікуванні пухлин.

Підводячи підсумок, ця робота надала більше розуміння того, як такі поживні речовини, як вітамін А та РА, переформували імунні реакції. Ці результати можуть надати нову стратегію лікування карциноми легенів.

ПОДЯКИ

Ми висловили особливу подяку доктору Хайжуо Го із Другої частини Першої лікарні Університету Цзілінь за допомогу в скануванні КТ. Ця робота була підтримана Національним фондом природничих наук Китаю (№ 81773412; 81501423), програмою Нормана Бетюна Університету Цзілінь (№ 2015223), Китайським докторським науковим фондом (2018M641787) та Фондом природничих наук провінції Цзілінь (20190103095JH ). Джерела фінансування не відігравали ролі в розробці та проведенні дослідження; збір, управління, аналіз та інтерпретація даних; підготовка, рецензування або затвердження рукопису; та рішення про подання рукопису для публікації.

КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ

Автори заявляють, що у них немає конфлікту інтересів.

ЕТИЧНИЙ ОГЛЯД

Це дослідження було проведено відповідно до Національних настанов щодо експериментального добробуту тварин та за схваленням Комітету з питань добробуту тварин та дослідницької етики в Університеті Цзілінь.

Зверніть увагу: Видавець не несе відповідальності за зміст або функціональність будь-якої допоміжної інформації, наданої авторами. Будь-які запити (крім відсутнього вмісту) слід направляти до відповідного автора статті.