Дефіцит нейропептиду Y послаблює реакцію на дієту натще і з високим вмістом жиру у мишей, схильних до ожиріння

Анотація

AGRP, пептид, пов’язаний з гуті
НЕТ, коричнева жирова тканина
КОШИК, стенограма, регульована кокаїном та амфетаміном
CRH, кортикотропін-рилізинг гормон
DIO, ожиріння, спричинене дієтою
MCH, концентрат меланіну, що концентрує
NPY, нейропептид Y
POMC, проопіомеланокортин
ПВН, паравентрикулярне ядро
UCP, роз’єднує білок

Енергетичний баланс передбачає складну взаємодію між гормонами, такими як лептин, інсулін та глюкокортикоїди, та ключовими нейронами в гіпоталамусі, стовбурі мозку та інших областях центральної нервової системи (1). Нейропептид Y (NPY) експресується в гіпоталамусі, стимулює споживання їжі, зменшує витрати енергії та збільшує масу тіла при введенні в мозок (1). Відповідно до ролі орексигенного пептиду, експресія гіпоталамусу NPY підвищується під час голодування та гіпоглікемії та пригнічується годуванням, лептином та інсуліном (1). Незважаючи на вагомі фармакологічні докази, що підтверджують його роль в енергетичному балансі, генетичні порушення NPY не впливали на годування та масу тіла мишей, виведених на змішаному тлі 129J-C57Bl/6J (2). Парадоксально, але видалення NPY або рецепторів Y1 та Y5, які опосередковують вплив NPY на енергетичний баланс, призвело до легкого ожиріння (3–6). Тим не менше, втрата NPY ослабленої гіперфагії та ожиріння у мишей Lep ob/ob (7). Інші також показали, що дефіцит NPY зменшує гіперфагію після голодування та гіпоглікемії (8–10). Крім того, видалення рецепторів NPY Y2/Y4 запобігає ожирінню, спричиненому дієтою (DIO) (11).

Ми розсудили, що суперечки щодо дії NPY у цих генетичних моделях частково зумовлені використанням штаму 129 мишей, стійкого до ожиріння (12). Здавалося б, нормальний фенотип мишей з дефіцитом NPY також може бути результатом компенсаторних змін розвитку. Наприклад, абляція нейронів гіпоталамусу, що експресує NPY/AGRP, не змінила годування у новонароджених мишей, тоді як абляція у дорослих спричинила голодування (13,14). AGRP коекспресується з NPY в дугоподібному ядрі, і обидва пептиди стимулюють годування та збільшення ваги (1,15). Можливо, що AGRP збільшується, коли не вистачає NPY, таким чином зберігаючи здатність годуватися. Альтернативно, анорексигенні пептиди, наприклад, проопіомеланокортин (POMC) та кокаїн- та амфетамінорегульований транскрипт (CART), можуть бути зменшені у мишей з дефіцитом NPY, тим самим запобігаючи втраті ваги. Ми припустили, що значення NPY в енергетичному гомеостазі буде очевидним у мишей C57Bl/6J, схильних до ожиріння (12,14).

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Дослідження проводились відповідно до керівних принципів та положень Комітету з догляду та використання тварин Університету Пенсільванії. Миші селекціонерів Npy +/− на змішаному тлі 129SvEv-C57Bl/6J були надані Річардом Палмітером (Університет Вашингтона, Сіетл, Вашингтон) і повернуті на 10 поколінь на задній план C57BL/6J (The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME ). Потім гетерозиготи були виведені між собою для генерування мишей NPYko та контролю дикого типу (2,3). Генотипи були підтверджені методом ПЛР, як описано раніше (3). Мишей відлучали від грудей через 3 тижні, їх утримували по п’ять у клітці при 22 ° C з 12-годинними світло-темними циклами (світиться в 06:00) і годували гризуном, що містив 4,5% жиру, 49,9% вуглеводів, 23,4% білка, 4 ккал/г (Labdiet No. 5001; Labdiet, Richmond, IN) (16).

Дослідження натщесерце та голодування.

Мишей у віці 10 тижнів поселяли поодиноко в калориметричні клітини і звикали протягом 3 днів. Вимірювали масу тіла, вводили попередньо зважену кількість їжі о 0900, а споживання кисню (V o 2) та вироблення вуглекислого газу (V co 2) вимірювали з інтервалом у 15 хвилин із використанням таких параметрів: витрата повітря 0,5 л, проба 0,4 л, час осідання 120 с та час вимірювання 60 с (система Oxymax EqualFlow; Columbus Instruments, Columbus, OH) (16,17). Мишей годували ad libitum протягом 48 годин або позбавляли їжі протягом 48 годин або годували протягом 48 годин. Побічну калориметрію проводили впродовж усього періоду, за винятком випадків, коли їжу виймали або замінювали. Рухову активність оцінювали одночасно за допомогою фотопроменів (Optovarimex; Columbus Instruments). NPYko та мишей дикого типу, яких годували, постили або переробляли, як описано, вбивали; кров отримували шляхом серцевої пункції, а коричневу жирову тканину (НДТ) та гіпоталамі швидко вирізали, заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C.

Толерантність до холоду.

Ректальну температуру вимірювали при кімнатній температурі (час 0) у 10-тижневих мишей дикого типу та самців NPYko за допомогою терморезистора (модель YSI 4600) (16), після чого мишей утримували при 4 ° C протягом 6 год.

Гібридизація in situ.

NPYko та мишей дикого типу знеболювали пентобарбіталом натрію в 0900–1100 і перфузували транскардально оброблений діетилпірокарбонатом PBS з подальшим 10% нейтральним забуференним формаліном. Мозок вирізали, постфіксували протягом ночі та кріозахистили у сахарозі. Експресія мРНК NPY, AGRP, POMC, меланін-концентруючого гормону (MCH) та кортикотропін-релізинг-гормону (CRH) виявляли на корональних зрізах (20 мкм) за допомогою специфічних рибопроб, як описано (18,19).

NPYko та мишей дикого типу годували звичайною дієтою чау (4,5% жиру, 49,9% вуглеводів, 23,4% білка, 4 ккал/г; Labdiet No 5001; Labdiet) або дієтою з високим вмістом жиру (45% жиру, 35% вуглеводи, 20% білка, 4,7 ккал/г; Дослідницькі дієти № D12451; Дослідницькі дієти, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) з 4-тижневого віку (16). Вагу тіла вимірювали щотижня. Споживання їжі та склад тіла (двоемісійна рентгенівська абсорбціометрія) та витрата енергії вимірювались на 4, 8 та 16 тижнях (16,20). Частоту подачі (розриви променя) оцінювали за допомогою системи Vitalview (Minimitter, Bend, OR). Дієти постачали в годівниці, оснащені фотопроменями, і діяльність годівлі аналізували за допомогою програмного забезпечення Actiview (www.minimitter.com/Products/VitalView/index.html). Мишей вбивали о 0900–1200 наступного дня, забирали кров через серцеву пункцію та збирали гіпоталамі.

Хімія тканин.

Рівні глюкози, тригліцеридів, холестерину та нестерифікованих жирних кислот у сироватці крові вимірювали за допомогою колориметричних аналізів (Stanbio, Boerne, TX; Wako Chemicals, Richmond, VA) (16,17,21). Інсулін та лептин вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (CrystalChem, Chicago, IL). Кортикостерон та тироксин вимірювали за допомогою радіоімунологічного аналізу (16,17,21). Експресію нероз'єднаного білка (UCP) -1 рівень мРНК в BAT вимірювали за допомогою Northern blot (17). Рівні мРНК гіпоталамічного нейропептиду вимірювали за допомогою ПЛР у режимі реального часу і нормалізували до фосфопротеїну рибосоми (16,17).

Статистика.

Вплив дефіциту NPY на різні параметри аналізували за допомогою тесту ANOVA та захищеної найменшої різниці (PSLD) Фішера. Регресійний аналіз проводили на безперервних змінних. Значення P o 2) було нижчим, ніж нічне, як у мишей дикого типу, так і у мишей NPYko (рис. 2А). V o 2 суттєво впав на 40–50% (P o 2 у мишей дикого типу відповідало різкому зменшенню експресії BAT UCP-1 (рис. 2D).

На відміну від мишей дикого типу, V o 2 залишався підвищеним у мишей NPYko, що голодували та переробляли (рис. 2А – С). Більше того, експресія BAT UCP-1 не потрапляла на голодних мишей NPYko (рис. 2Е). На відміну від цього, миші дикого типу та NPYko підтримували температуру тіла під час впливу холоду (рис. 2F). Дефіцит NPY не впливав на рухливу активність під час голодування або повторного годування (дані не наведені). Як і у мишей дикого типу, рівень глюкози, інсуліну, лептину, тироксину та тригліцеридів знижувався, а кортикостерон збільшувався у мишей NPYko, що голодували (табл. 1). Ці зміни були скасовані після повторного підживлення (Таблиця 1).

Ми визначили, чи впливатиме дефіцит NPY на рівень нейропептидів гіпоталамусу, причетних до енергетичного гомеостазу (1). Експресія AGRP була обмежена дугоподібним ядром як у мишей дикого типу, так і у мишей NPYko (рис. 3А та В). Однак рівні мРНК AGRP були в два рази вищими у NPYko, ніж у мишей дикого типу (рис. 3A – D). AGRP збільшували голодуванням і придушували годуванням у мишей дикого типу (рис. 3С). На відміну від цього, у мишей NPYko не було очевидних змін рівня мРНК AGRP під час голодування або повторного годування (рис. 3D). Розподіл POMC, CRH та MCH не змінювався дефіцитом NPY (дані не наведені). Експресія POMC впала у відповідь на голодування як у мишей дикого типу, так і у мишей NPYko і зросла після повторного годування (рис. 3E та F). MCH збільшився, а КАРТ зменшився у голодних мишей дикого типу та NPYko, і ці зміни були скасовані шляхом повторного годування (дані не показані).

Дефіцит NPY послаблює DIO у мишей C57Bl/6J.

Самці та самки мишей NPYko продемонстрували значне зниження маси тіла та вмісту жиру під час дієти з високим вмістом жиру (рис. 1A – D). Маса тіла була значно нижчою у самців мишей NPYko з високим вмістом жиру на 12 тижнів, а у самок мишей NPYko на 16 тижнів у порівнянні з мишами дикого типу з високим вмістом жиру (P o 2 також була вищою у мишей NPYko з високим вмістом жиру (3778 ± 66 мл · кг -1-1 год −1), ніж миші дикого типу з високим вмістом жиру (3415 ± 48 мл · кг -1 год · -1) (рівень P o 2 залишався підвищеним у мишей NPYko, що голодували, і тісно паралельно збільшенню BAT UCP- 1. Цікаво, що дефіцит NPY не впливав на температуру тіла під час впливу холоду, що припускає, що NPY відіграє вирішальну роль у терморегуляційній реакції на голодування, але не на холодний стрес.

Абляція нейропептиду може змінити експресію інших нейропептидів, як показано збільшенням експресії NPY у дорсомедіальному ядрі при порушенні рецептора MC4 (28). Ми виявили, що експресія AGRP обмежена дугоподібним ядром, але рівні мишей значно збільшені у мишей NPYko, що передбачає компенсацію розвитку дефіциту NPY. З іншого боку, розподіл та рівні POMC, CRH та MCH не змінювались у мишей NPYko. Таким чином, ми припускаємо, що, здавалося б, нормальна вага мишей NPYko в умовах, що харчуються ad libitum, принаймні частково зумовлена орексигенною дією AGRP. Однак AGRP не зміг збільшитись протягом голодування у мишей NPYko, що може пояснити, чому постшвидка гіперфагія та відновлення ваги ослаблені у мишей NPYko.

Це дослідження підкреслює важливість генетичного фону при ожирінні, цукровому діабеті та аномаліях ліпідів (12,19,26,27). Хоча штам C57Bl/6J дуже сприйнятливий до гіперфагії, ожиріння, резистентності до інсуліну та діабету, штам 129, який зазвичай використовується для експериментів з нокаутом генів, стійкий до ожиріння (33–35). Як ми і передбачали, орексигенна дія NPY стала очевидною у штамі C57Bl/6J, який сприйнятливий до ожиріння. Дефіцит NPY притупив гіперфагію та збільшення ваги у мишей, що голодували та DIO C57Bl/6J. Ми вважаємо, що NPY є важливою складовою "економного генотипу", який оптимізує накопичення енергії. Під час голодування NPY, ймовірно, діятиме спільно з іншими пептидами гіпоталамусу, щоб зменшити витрати енергії, стимулювати апетит та поповнити запас енергії. Ця адаптивна реакція, щонайменше частково, сигналізувала про падіння рівня лептину та інсуліну і, можливо, еволюціонувала як захист від загрози голоду (1,36). З іншого боку, NPY може схилити до ожиріння у генетично сприйнятливих людей, стимулюючи споживання їжі та зменшуючи витрати енергії, коли їжі багато.