Цілеспрямоване порушення гістамін H1-рецептора послаблює регулятивний вплив лептину на годування, ожиріння та сім’ю UCP у мишей

Анотація

Нейрони гістаміну, що походять з туберо-соскоподібного ядра заднього гіпоталамуса, дифузно проектуються в мозок для регулювання енергетичного гомеостазу (1,2). Показано, що нейрональний гістамін пригнічує споживання їжі за допомогою гістамінових H1-рецепторів (H1-Rs) у вентромедіальному гіпоталамусі (VMH) та паравентрикулярному ядрі (PVN) (3,4). Це також змінює терморегуляцію (5). Дефіцит енергії в мозку, тобто нервова глюкопривація, активує гістамінові нейрони в гіпоталамусі (6) і посилює глікогеноліз у мозку (7). Нейрони гістаміну стимулюють симпатичну нервову систему до посилення ліполізу в жировій тканині (8,9).

Нещодавно було продемонстровано, що лептин, продукт гена ob (10), сприяє обміну гістаміну, впливаючи на процес транскрипції утворення гістидину декарбоксилази або вивільнення гістаміну як такого (11). Крім того, концентрація або швидкість обороту гіпоталамічного гістаміну була знижена у мишей, що мають дефіцит лептину ob/ob та мутації рецепторів лептину db/db, але вона була збільшена у людей, що страждають ожирінням, спричинених дієтою (11). Лептин регулює метаболічну ефективність і надає аноректичну дію (12,13,14) за допомогою своїх рецепторів довгої форми гіпоталамусу, в VMH, дорсомедіальному гіпоталамусі, дугоподібному ядрі та вентральному премміллярному ядрі (15,16,17). VMH, PVN і дугоподібне ядро відомі як контрольні центри апетиту і отримують проекції від нейронів гістаміну (3,4,18,19).

З точки зору енергетичного метаболізму, сімейство роз'єднаних білків (UCP) відіграє важливу роль в енергетичному гомеостазі (20, 21, 22). Експресія генів цих білків регулюється гуморальними та нейрональними факторами (23,24,25,26,27,28). Центральне введення гіперрегульованої експресії лептину з сімейства UCP (28). Ці висновки дозволяють припустити, що передача сигналу між нейронами лептину та гістаміну може брати участь у центральній регуляції сімейства UCP.

Зростаюча кількість швидко прогресуючої інформації про функціональні ролі гістамінових нейронів разом з їх центральними сигнальними шляхами узгоджується з концепцією, згідно з якою гіпоталамічні гістамінові нейрони, швидше за все, сприяють центральному регулюванню енергетичного балансу, керованого лептином. Щоб вирішити цю проблему, ми висунули гіпотезу, що нокаутування H1-R (H1KO) може порушити сигнальні сигнали лептину, починаючи від експресії нейропептидів гіпоталамуса і до сімейства UCP та гена ob. Метою цього дослідження було вивчити суттєву роль H1-R у регуляції споживання їжі та експресії UCP.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Тварини. Зрілі самці мишей C57Bl/6J (Seac Yoshitomi, Фукуока, Японія) та мишей H1KO (Університет Кюсю, Фукуока, Японія) у віці 0-30 тижнів були поміщені в кімнату, щодня освітлену з 0700 до 1900 (12: 12). h цикл світло-темно) при температурі 21 ± 1 ° C і вологості 55 ± 5%. Мишам був наданий доступ до стандартної порошкоподібної їжі для мишей (CLEA Японія, Токіо, Японія) та водопровідної води за бажанням. Щоденне споживання їжі та вага тіла мишей вимірювали о 0800. Вимірювання контролювали принаймні за 7 днів до кожного експерименту. Тварин, яких використовували, обробляли відповідно до Керівних принципів догляду та використання лабораторних тварин Оітського медичного університету.

Виробництво та постачання мишей H1KO. Самців та самок мишей H1KO утримували для зворотного схрещування в Медичному інституті біорегуляції (Університет Кюсю). Про методи, що використовуються для отримання цих мишей, детально повідомляється в інших місцях (29). Зворотне схрещування гомозиготних мишей H1R -/- із штамом C57Bl/6J протягом п’яти поколінь призвело до того, що тут використовувались початкові вроджені миші N4 трьох генотипів (H1R -/-, H1R +/-, H1R +/+). Усі генотипи були підтверджені за допомогою Саузерн-блот. Загалом у віці 28 днів було проаналізовано 178 нащадків гетерозиготних самців та самок на генотип. Спостерігався такий розподіл: +/+, n = 42; +/-, n = 90; -/-, n = 46. Ці результати повністю відповідають очікуваному співвідношенню 1: 2: 1, вказуючи на те, що дефіцит H1-R не впливає негативно на життєздатність до або після пологів.

Вимірювання споживання їжі та кривої зростання. Швидкість росту самців мишей H1KO та дикого типу (WT) (6 мишей/група) відстежували від їх відлучення у віці від 1 тижня до 30-тижневого періоду. Їх щоденне споживання їжі протягом 24 годин вимірювали у віці 12 та 30 тижнів. Ці миші були утримувані поодинці протягом 30-тижневого періоду моніторингу в умовах акліматизованого навколишнього середовища, описаних вище.

Навантаження мишей з дієтою з високим або низьким вмістом жиру. Відповідно до маси тіла у віці 8 тижнів мишей H1KO та WT поділяли на групи з високим вмістом жиру (HFD) та дієти з низьким вмістом жиру (LFD) (n = 6 для кожної підгрупи). HFD складався з 45% жиру, 35% вуглеводів і 20% білка з щільністю енергії 4,73 ккал/г. LFD складався з 10% жиру, 70% вуглеводів і 20% білка з щільністю енергії 3,85 ккал/г. Вагу тіла у кожній підгрупі вимірювали щотижня у віці від 8 до 16 тижнів. Загальну масу жиру, відсоток жиру та експресію гена ob у WAT вимірювали у віці 16 тижнів.

Хронічна імплантація канюлею в бічний шлуночок. Дорослих мишей-самців у віці 12-14 тижнів знеболювали за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції нембуталу (1 мг/кг). Мишей поміщали в стереотаксичний пристрій для імплантації 29-каліброва канюлі з нержавіючої сталі хронічно в лівий бічний церебровентрикуляр (0,5 мм ззаду, 1,0 мм з боків і 2,0 мм з боку брюгми). Після операції в кожну канюлю вставляли дротяну пробку калібру 30, щоб запобігти згортанню крові. Всім мишам було дозволено 1 тиждень післяопераційного відновлення, перш ніж їм обробляли щодня, щоб вирівняти рівень збудження. Після припинення всіх експериментів перевіряли розміщення канюлі у кожної миші, напоєної барвником Індіана зелений.

Процедури лікування лептином. Мишачий рекомбінантний лептин (Amgen, Thousand Oaks, CA) розчиняли у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS). Щоб отримати взаємозв'язок доза-відповідь, лептин вводили в лівий бічний церебровентрикул у дозах 0,1, 0,25 та 0,5 мкг/мишу щодня протягом 3 послідовних днів. Процедури вливання PBS у контрольній групі були такими самими, як і в групі лептину, де це було застосовано. Об’єм інтрацеребровентрикулярної інфузії лептину та PBS становив 0,1 мкл. Відповідно до базової маси тіла у віці 12-14 тижнів мишей H1KO та WT поділяли на лептин та контрольну групу (n = 6 для кожної). Напередодні та протягом 3 днів після лікування споживання їжі вимірювали щодня у кожній підгрупі (n = 6 для кожної підгрупи). Щоб запобігти різниці в споживанні їжі між лептином та контрольною групою, контрольних мишей у кожному дослідженні інфузії лептину годували в парі щодня з відповідними мишами, які отримували лептин. Після оцінки годування жирові тканини хірургічно видаляли згідно з вищезазначеними процедурами та аналізували на накопичення жиру та експресію UCP.

Вилучення РНК та аналіз нозерн-блот. Загальну клітинну РНК готували з різних тканин миші із застосуванням ізогену (ген Nippon, Тояма, Японія) відповідно до протоколу виробника. Загальну РНК (20 мкг) електрофорезували на 1,2% формальдегід-агарозному гелі, а відокремлену РНК переносили на мембрану Biodyne B (Pall Canada, Торонто, Онтаріо, Канада) у 20 × хлориду натрію цитрату шляхом блокування капілярів та іммобілізації під впливом ультрафіолету (0,80 Дж). Передгібридизацію та гібридизацію проводили згідно з протоколом виробника. Мембрани промивали в умовах високої жорсткості. Після промивання мембран сигнали гібридизації аналізували за допомогою БІО-аналізатора зображень BAS 2000 (Фільмовий інститут Фудзі, Токіо, Японія). Мембрани видаляли під впливом кип'ятіння 0,1% SDS і регібридизували з рибосомною РНК, яка використовувалась для кількісної оцінки кількості видів РНК на ляпках.

Статистичний аналіз. Всі дані були виражені як середнє значення ± SE. Статистичний аналіз різниці оцінювали методом Шеффе або повторним двостороннім дисперсійним аналізом (рис. 1,2,3,4), а там, де це було доречним, застосовували неспарений t-тест для множинних порівнянь (таблиця 1, рис. 1). Для оцінки кривої доза-реакція щодо впливу інтрацеребровентрикулярної інфузії лептину на споживання їжі було проведено коефіцієнт кореляції Спірмена за рангом.