Статистично розроблена середовище виявляє взаємодію між метаболізмом та обробкою генетичної інформації для виробництва стабільного альбуміну сироватки людини у Pichia pastoris

Схема побудови двокопійного вектора сироваткового альбуміну людини (HSA) (червона область позначає касету експресії HSA). Наведені розміри не відповідають фактичному масштабу.

(а) Аналіз електрофорезу на додецилсульфат натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) загального позаклітинного білка, що продукується в неоптимізованих (стандартних Invitrogen) умовах, Доріжка 1: Білкова сходи. Супернатант культури (20 мкл) від клону № 52 (одна копія HSA): Провулок 2, та клону № 14 (дві копії HSA): провулок 3. Стрілка вказує смугу HSA. (b) Матричний спектр пептидного лазерного десорбційного/іонізаційного часу прольоту (MALDI/TOF) білкової смуги від клону №14.

(а) Діаграма Парето, отримана з конструкції Плакетта-Бурмана, що представляє порядок та% внеску кожного параметра у виробництво стабільного HSA. Синій та помаранчевий кольори представляють негативний та позитивний внесок відповідно. (b) Оцінений вплив незалежних змінних на вироблення HSA клоном № 14. Червоний колір вказує на найбільш значущі, а синій - несуттєві параметри.

Тривимірні графіки поверхні відгуку та контурні графіки, що вказують на вплив окремих параметрів та взаємодію між двома параметрами. Вплив комбінованого впливу температури та метанолу (а), пептону та температури (б), а також метанолу та пептону на виробництво HSA (с). Кореляція між прогнозованою та спостережуваною реакцією (Y як HSA, що виробляється в мг/л) (d).

(а) Загальне вироблення позаклітинного білка, ІФА, гель-денситометрія аналізу секретованого HSA у двох копіях клонів №10, 14 та в клонах однокопійного типу 52 в оптимізованих (O) та неоптимізованих (U) умовах середовища. (b) SDS-PAGE аналіз фільтрату культури з клонів, згаданих у (а). Провулок 1 - Білкова драбина, Доріжки 2, 4-Клони 10, 14, в оптимізованих умовах та Провулки 3, 5 на неоптимізованому середовищі. Доріжки 6, 7 показують позаклітинний білковий профіль клону # 52 в оптимізованому та неоптимізованому станах відповідно.

(а) Аналіз життєздатності клітин (MTT) з клітинними лініями Vero. Зміни складності в проліферації вимірювали за відсутності будь-якої плодової бичачої сироватки (FBS) (▲), 5% FBS (■) або 10% FBS (●), 5% FBS + 1 г/л комерційного HSA (▼), 5 % FBS + очищений HSA 0,5 г/л (○), або 5% FBS + очищений HSA 1 г/л (◆). (b) SDS-PAGE аналіз очищеного HSA від клону № 14, культивованого на оптимізованому середовищі. Доріжка 1: Маркер, Доріжка 2: Комерційний HSA (4 мкг), Доріжка 3: 4 мкл фракції швидкої білкової рідинної хроматографії (FPLC). (c) Статистичну значимість різниці визначали парним t-тестом, беручи 5% FBS в якості стандартного еталону для експериментів з проліферацією клітин.

(a) Гени, регульовані в метаболізмі вуглецю в оптимізованих умовах (b) Гени, регульовані в метаболізмі азоту відповідно до шляхів KEGG в оптимізованих та неоптимізованих умовах. Інтенсивність вгору (показано червоним) і регульованого вниз (зеленого) гена відображається кількістю стрілок. Одна стрілка відображає log2fold одиницю зміни 1.

(а) Гени, що регулюються в посттранскрипційному шляху в оптимізованих та неоптимізованих умовах. (b) Гени, що регулюються при транспортуванні білка до ER, згортанні та секреторному шляху в оптимізованих та неоптимізованих умовах.

Якісний аналіз полімеразної ланцюгової реакції (QPCR) деяких (a) вгору та (b) генів, регульованих вгору та вниз, в оптимізованих та неоптимізованих умовах середовища. (c) Біологічна функція генів, згаданих у (а) та (b).

Анотація

1. Вступ

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

2.2. Штами та конструкція одно- та двокопійних експресійних касет HSA

2.3. Лінії клітин тварин та набір для аналізу розповсюдження клітин

2.4. Вирощування рекомбінантного HSA, що продукує P. pastoris, на неоптимізованому та оптимізованому середовищі та оптимізація виробництва HSA за допомогою методології реакційної поверхні

2.5. Аналіз очищення та розмноження клітин рекомбінантного HSA

2.6. Аналіз транскриптома

2.7. qPCR Перевірка ідентифікованих цільових генів

Діаметр 4 мм. Детальна інформація щодо підготовки кДНК та реакцій qPCR наведена в Додатку В. Гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназа (GAPDH) була використана як контрольний ген для ведення домашнього господарства з X-33 в якості контрольного господаря. Різницю кратності рівнів стенограми розраховували наступним чином [29]:

2.8. Аналітичні методи

3. Результати

3.1. Кодон-оптимізація власного HSA та виробництво у P. pastoris

230 ± 35 мг/л) на рівні 100 мл. Трипсинове перетравлення смуги при

Положення 66 кДа (рис. 2а) з подальшим аналізом MALDI-TOF вказувало на наявність кількох пептидних фрагментів (рис. 2б). Їх можна порівняти з теоретичними пептидами, які очікуються після перетравлення трипсином інтактного HSA. Це підтвердило, що білок розсмоктався при

Положення 66 кДа в електрофорезі додецилсульфату натрію-поліакриламідного гелю (SDS-PAGE) було таким, як HSA.

3.2. Середнє проектування та оцінка секретного HSA

290 мг/л (запуск №12) (таблиця S1 у додатковому файлі). Використання моделі множинної регресії дозволило встановити кореляцію між сімома факторами та виробництвом стабільного HSA. З результатів діаграми Парето (рис. 3а) та оцінених ефектів (рис. 3б) було помічено, що температура, рівень метанолу та концентрація пептону у фазі індукції мали максимальний вплив на вироблення стабільного HSA. Їх процентний внесок становив 40,

28 та 25% відповідно, що становить 93% ефекту. Аналіз, заснований на дисперсійному аналізі (ANOVA, див. Таблицю S4 у додатковому файлі), показав, що значення p моделі становило 0,0022 (2), дорівнювало 0,9990, що показало, що 99,9% варіації вартості виробництва HSA може бути продемонстровано незалежним фактори, обрані в цьому дослідженні. Відповідне значення точності 82,18 (яке було >> 4) вважається бажаним і вказує на те, що модель може бути використана для вивчення дизайнерського простору.