Біохімічна та функціональна характеристика взаємодії між Liprin-α1 та GIT1: наслідки для регулювання рухливості клітин

Співпрацювали в цій роботі з: Клаудією Асперті, Веронікою Астро

функціональна

Відділ неврології, Науковий інститут Сан-Раффаеле та Університет Сан-Раффаеле, Мілан, Італія

Співпрацювали в цій роботі з: Клаудією Асперті, Веронікою Астро

Відділ неврології, Науковий інститут Сан-Раффаеле та Університет Сан-Раффаеле, Мілан, Італія

Відділ неврології, Науковий інститут Сан-Раффаеле та Університет Сан-Раффаеле, Мілан, Італія

Відділ неврології, Науковий інститут Сан-Раффаеле та Університет Сан-Раффаеле, Мілан, Італія

Афілійований відділ генетики та клітинної біології, Науковий інститут Сан-Раффаеле, Мілан, Італія

Відділ неврології, Науковий інститут Сан-Раффаеле та Університет Сан-Раффаеле, Мілан, Італія

  • Клавдія Асперті,
  • Вероніка Астро,
  • Емануела Петтінато,
  • Симона Періс,
  • Анжела Бачі,
  • Іван де Кертіс

Цифри

Анотація

Цитування: Asperti C, Astro V, Pettinato E, Paris S, Bachi A, de Curtis I (2011) Біохімічна та функціональна характеристика взаємодії між Liprin-α1 та GIT1: наслідки для регулювання рухливості клітин. PLOS ONE 6 (6): e20757. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020757

Редактор: Медді Парсонс, Королівський коледж Лондона, Великобританія

Отримано: 27 січня 2011 р .; Прийнято: 9 травня 2011 р .; Опубліковано: 13 червня 2011 р

Фінансування: Наступні джерела фінансування Івана де Куртіса підтримали цю роботу: AIRC, Італійська асоціація досліджень раку, грант № 10321 (http://www.airc.it/) Fondazione Cariplo (http://www.fondazionecariplo.it /portal/sv1.do) Telethon — Італія, грант GGP09078 (http://www.telethon.it/). Більше того, стипендія від FIRC, Італійський фонд досліджень раку (http://www.fondazionefirc.it/) підтримала Вероніку Астро. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Міграція клітин вимагає складних молекулярних подій, які потребують тонкого регулювання у часі та просторі [1]. GIT1 (взаємодіючий з білками рецептор-кіназою білок 1) та GIT2/PKL утворюють сімейство мультидоменних білків ArfGAP з активністю риштування, які беруть участь у регулюванні адгезії та міграції клітин на позаклітинному матриксі [2]. Вони взаємодіють через SHD (домен гомології Spa2) з компонентами сімейства PIX (активований p21-кіназо-взаємодіючий обмінний фактор) факторів обміну нуклеотидних гуанінів для Rac та Cdc42 GTPases [3] - [5]. Більше того, карбокси-кінцева область білків GIT може взаємодіяти з білками-адаптерами паксиліном [6], [7] та ліприном-α1 [8], причетні до утворення та обміну опосередкованих інтегрином FA (фокальних спайок) [9 ] - [11].

Білки GIT беруть участь у різних шляхах, які регулюють рухливість клітин. Наприклад, GIT1 бере участь у EGF-залежній міграції судинних гладком'язових клітин [12], тоді як другий член сімейства, GIT2 є ключовим фактором для хемотаксичної спрямованості в стимульованих нейтрофілах [13], і необхідний для PDGF-залежного спрямованого міграція клітин та полярність клітини, але не для випадкової міграції [14].

Було запропоновано, що GIT1 може кружляти між принаймні трьома різними субклітинними компартментами, включаючи FA, передній край та цитоплазматичні компартменти, а функціональна взаємодія між GIT1, βPIX та PAK пов'язана з протрузійною активністю клітин та їх міграцією [15], [ 16]. З іншого боку, точна функція комплексів GIT у рухливості клітин все ще недостатньо зрозуміла, і наявні висновки призвели до суперечливих повідомлень про те, позитивно [17] чи негативно [18] впливає набір, опосередкований GIT, комплексів [18]. випинання.

Локалізація GIT1 на передньому краї може зіграти певну роль у наборі активатора GTPase βPIX та ефектора PAC Rac в одному і тому ж місці, обмежуючи тим самим активність Rac1 до передньої частини рухомих клітин, де необхідна складання актину [19] - [ 21]. Було показано, що GIT1 регулює протрузійну активність на межі клітини, і що комплекс GIT1/PIX/PAK рекрутується білком FA-паксиліном у динамічних периферичних адгезивних структурах для регулювання їх обороту [17].

Ліпріни - це сімейство білків, які включають підродини ліпрін-α та -β [10]. Білки ліпрін-α - це мультидоменні білки, які можуть безпосередньо взаємодіяти з кількома зв'язуючими партнерами. Недавня робота показала, що ліпрін-α1 є важливим регулятором рухливості клітин та інвазії клітин пухлини [11], [22] - [24], але точне значення та роль різних комплексів ліпрін-α/партнер у регуляції клітин моторика недостатньо вивчена [25]. Ми показали, що взаємодія GIT1 з ліприном-α1 та паксиліном повинна регулюватися. Насправді як ліпрін-α1, так і паксилін погано взаємодіють з білком GIT1 повної довжини, тоді як вони ефективно взаємодіють з карбокси-кінцевими фрагментами GIT1 або з поліпептидами GIT1 з обмеженими внутрішніми делеціями [26], що свідчить про те, що функція GIT1 регулюється внутрішньомолекулярно механізм. Відповідно, надмірна експресія “активного” усіченого білка GIT1-C, але не білка повної довжини, призводить до посиленого поширення клітин [26].

У цьому дослідженні ми проаналізували біохімічну та функціональну взаємодію між ліприном-α1 та GIT1, щоб дослідити роль цієї взаємодії у рухливості клітин. Експериментами з ко-імунопреципітацією ми показали, що GIT1 може утворювати альтернативні комплекси як з паксиліном, так і з ліприном-α1. Більше того, ми виявили, що GIT1 необхідний для опосередкованого ліпрін-α1 клітинного розповсюдження та міграції, хоча пряма взаємодія між двома білками, схоже, не є суттєвою для цих процесів. Нарешті, ми продемонстрували зворотний ефект ліприну та GIT на їх локалізацію у ФА на краю клітини, що корелювало зі здатністю двох білків взаємодіяти один з одним.

Результати і обговорення

Ліпрін-α1 перешкоджає зв'язуванню паксиліну, але не βPIX з GIT1

Паксилін взаємодіє з карбокси-кінцевою областю щурячого GIT1, включаючи залишки 640–770 (залишки 610–740 у курчат GIT1) за допомогою мотивів LD [7], [28]. Як і очікувалося, ендогенний паксилін співіснував із FLAG-GIT1 (512–740), що включає повну область зв’язування паксиліну [7] (рис. S1, E). З іншого боку, конструкції, що включають короткі делеції на карбокси-кінці [FLAG-GIT1 (229–680) та FLAG-GIT1 (229–667)], скасували взаємодію як з ліприном-α1, так і з паксиліном (рис. S1, C– Г). Загалом результати показують, що розширена область карбокси-кінцевої частини GIT1 потрібна для ефективної взаємодії з ліприном-α1, і що область GIT1, необхідна для зв'язування з ліприном-α1, включає область, що зв'язує паксилін.

GIT1 та βPIX утворюють стабільні гетерокомплекси в клітинах COS7 [26]. Таким чином, ми перевірили, чи зв'язування βPIX із доменом SHD GIT1 перешкоджає зв'язуванню ліпріну-α1 із суміжним карбокси-кінцем GIT1. Ми використовували ко-імунопреципітацію з трансфікованих клітинних лізатів, щоб перевірити можливу інтерференцію між зв'язуванням ліпріну-α1 та βPIX з GIT1. Клітини COS7, котрансфіковані HA-GIT1-C2 та HA-βPIX, HA-GIT1-C2 та FLAG-Liprin-α1, або потрійно трансфіковані HA-GIT1-C2, HA-βPIX та FLAG-Liprin-α1 імунопреципітований антитілами проти FLAG. Подібні кількості GIT1-C2 ко-імунопреципітували з антиліприн-α1 антитілами у присутності або відсутності βPIX, що вказує на те, що зв'язування ліпріну-α1 з GIT1-C2 не впливає на взаємодію GIT1-C2 з βPIX (рис. 1, Б). Ці результати вказують на те, що GIT1 може знаходитися в комплексі як з βPIX, так і з ліприном-α1 одночасно. З іншого боку, ми виявили, що імунопреципітація βPIX з ко-трансфікованих клітин призводила до ефективного спільного осадження GIT1-C2 як у присутності, так і у відсутності ліприну-α1 (рис. 1, С). Ці результати показують, що в клітині може утворюватися тримерний комплекс βPIX/GIT1/Liprin-α1.

Раніше ми показували, що зв'язування паксиліну з ендогенними або надмірно експресованими комплексами GIT1/βPIX зазвичай не виявляється і вимагає активації GIT1 за невідомими механізмами. Подібним чином, ліпрін-α1 погано взаємодіє з GIT1 повної довжини, тоді як ефективно взаємодіє з мутантами делеції GIT1, що імітують активовану форму GIT1 [26]. Що стосується паксиліну, ми не змогли виявити взаємодію ендогенного ліпріну-α1 з ендогенними комплексами GIT/PIX після імунопреципітації з лізатів COS7 (рис. 1, D). Більше того, як вже було показано для паксиліну, коекспресія βPIX не покращила зв'язок надмірно експресованого ліпріну-α1 з надмірно вираженим GIT1 на всю довжину (рис. 1, Е). Отже, ми можемо зробити висновок, що зв'язування βPIX з GIT1 недостатньо для активації зв'язування цих лігандів з карбокси-кінцевою частиною GIT1.

GIT1 необхідний для ефективного розповсюдження клітин, опосередкованого ліпріном-α1

(А) Надмірна експресія ліприну-α1 впливає на локалізацію ендогенного ЖКТ на периферійних ФА. Клітини COS7, які надмірно експресують або FLAG-ліприн-α1, або FLAG-βгалактозидазу, висівали на 1 год на FN і імуно забарвлювали для трансфікованого білка та ендогенного GIT. Шкала, 20 мкм. Права панель: чотирикратне збільшення поля в коробці; Надмірна експресія ліпріну-α1 (клітина зірочкою) зменшує накопичення ЖКТ у новоутворених ФА на краю трансфікованих клітин (наконечники стрілок). Шкала, 5 мкм. (B) Клітини, трансфіковані FLAG-βгалактозидазою, FLAG-ліприном-α1 або FLAG-ліприном-ΔCC3, висівали на 1 год на FN перед фіксацією та фарбуванням для трансфікованого білка та для ендогенних білків GIT та FAK. Шкала, 20 мкм. (C) Високе збільшення краю трансфікованих клітин показує, що ендогенний GIT добре перекривається з FAK на периферійних ФА клітин, що трансфікуються FLAG-ліприном-ΔCC3, тоді як слабке перекриття між ендогенними GIT і FAK спостерігається на периферійних FAs FLAG-ліприн-α1 експресують клітини. Шкала, 10 мкм. Панелі праворуч - це 3-кратне збільшення площ, позначених наконечниками стрілок на відповідних зображеннях зліва.

Серед «активованих» форм GIT1 ми показали, що GIT1-C (рис. S1, H, амінокислотні залишки 346–740) зміг конкретно збільшити розповсюдження клітин та реорганізацію краю клітини, одночасно надмірно виражаючи довжина білка не виявляла очевидного впливу на розповсюдження порівняно з контрольними клітинами (рис. 4, A – B). Подібно до того, що ми спостерігали після надмірної експресії ліприну-α1, GIT1-C викликав втрату паксиллін-позитивних ФА з центральної частини розповсюджуваної клітини та концентрацію паксилін-позитивних малих ФА на краю клітини (рис. 4, А ). Для подальшого вивчення взаємодії між ліприном-α1 та GIT1 під час розповсюдження клітин ми протестували ефекти експресії усіченого активного білка GIT1-C на локалізацію ендогенного ліприну-α1 на краю клітини, що розповсюджується клітинами. Експресія GIT1-C, яка може зв'язувати або паксилін, або ліприн-α1 (рис. S1), змогла посилити накопичення ендогенного ліпріну-α1 до краю клітини, де ліпрін частково колокалізувався з паксилін-позитивними ФА (рис. . 4, С). Колокалізація ліпріну-α1 паксилін-позитивними ФА була набагато очевиднішою в клітинах, трансфікованих GIT1-C, порівняно з контрольними клітинами.

(A) Клітини COS7, трансфіковані протягом однієї доби або FLAG-GIT1, FLAG-GIT1-C, або FLAG-β-галактозидазою, повторно висівали на 1 год на FN. Імунофлуоресценція для трансфікованих білків (FLAG), паксиліну та фаллоїдину, що забарвлюють F-актин. Шкала, 20 мкм. Нижче показано 3-кратне збільшення ділянок клітин, забарвлених на паксилін (наконечники стрілок у відповідних клітинках вище). (B) Експресія GIT1-C індукує значне збільшення поширення клітин на FN. Стовпчики є середніми значеннями ± SEM (n = 116–121 клітин на умову); * P Малюнок 5. GIT1 необхідний для міграції клітин COS7 з ліпріном-α1.

(А) Трансфіковані клітини замінювали на 10 мкг/мл FN протягом 50 хв, щоб забезпечити розповсюдження, а потім контролювали рухливість протягом 2,5 год, беручи один кадр кожні 5 хв. На верхніх панелях показані сліди клітин від клітин, трансфікованих зазначеними конструкціями. На нижній панелі показано кількісне визначення (середні значення ± SEM) різних параметрів випадкової міграції, включаючи доріжки клітин (шлях), відстань Евкліда (дисплей), швидкість шляху (Vp), швидкість Евкліда (Vd) та стійкість міграції (persist = шлях/виклад). N = 18–20 клітин на експериментальний стан; * P 5′-GCCTGGATGGAGACCTAGA-3 ′ та 5′-AGCCAACCCCCAAGACAAATT -3 ′ відповідно зеленої мавпи людини GIT1, відповідно.

Культура клітин та трансфекція

Клітини COS7 та HeLa (з Американської колекції типових культур, Теддінгтон, Великобританія) вирощували в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (Cambrex Bio Science Verviers SPRL, Charles City, IA) з 10% сироватки. Клітини, трансфіковані Lipofectamine 2000TM (Invitrogen) або Fugene (Roche, Manheim, Germany), та 2-3 мкг плазмід, або siРНК (50-100 нМ), використовували відповідно через 1-2 дні, відповідно.

Імунопреципітація та імуноблотинг

Клітини лізували 0,5–1% Triton X-100, 20 мМ Tris-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ортованадату натрію, 10 мМ фтористого натрію та інгібіторів протеази. Аликвоти по 200–1000 мкг кожного лізату інкубували із зазначеними антитілами, попередньо зв’язаними з білками А-сефарози (Amersham, Little Chalfont, Великобританія). Імунопреципітацію ендогенного паксиліну проводили кон’югуванням білків білка А Сефароза з 2 мкл кролячого анти-мишачого Ig (Sigma-Aldrich) та 1 мкг анти-паксилінового mAb (BD Biosciences Transduction Laboratories). Для імуноблотингу первинні антитіла візуалізували за допомогою ECL або 125 I-анти-мишачих Ig або білка А (Amersham).

Аналіз мас-спектроскопії

Для експресії злитого білка ZZ-GIT1-C2 при індукції IPTG використовували бактерії BL21, трансформовані pQE60ZZ-GIT1-C2. Злитий білок ZZ-GIT1-C2 включає карбокси-кінцевий фрагмент GIT1, зв’язаний з двома послідовними IgG-зв'язуючими доменами білка А. Бактерії лізували і злитий білок очищали на гранулах IgG Sepharose 6 (Amersham). Для очищення ZZ-GIT1-C2-зв'язуючих білків усі процедури проводили при 0–4 ° C. 45 мг білка з лізату мозку курчат E12-E13 (буфер лізису: 1% Triton X-100, 20 мМ Tris-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ DTT, 10 мМ ортованадат натрію, 1 мМ фторид натрію, анти- суміші протеази) інкубували із ZZ-GIT1-C2, попередньо адсорбованим до 75 мкл IgG-гранул. Після інкубації протягом 1,5 год з обертанням гранули промивали, переносили в колонку, додатково ретельно промивали і двічі елюювали 0,5 М оцтовою кислотою (рН 3,4). Контрольні зразки включали гранулки IgG-сефарози, інкубовані з лізатом мозку (за відсутності білка ZZ-GIT1-C2), і гранули IgG-сефарози, покриті білком ZZ-GIT1-C2 (за відсутності лізату мозку). Чверть кожного елюату та гранул, що залишилися після елюції оцтовою кислотою, аналізували за допомогою SDS-PAGE на 6% акриламідних гелях.

Для ідентифікації білків цікаві смуги вирізали із забарвлених сріблом гелів SDS – PAGE, редукували, алкілювали та розщеплювали протягом ночі бичачим трипсином, як описано в іншому місці [40]. Один мкл супернатанту травлення використовували для аналізу MALDI-часу польового мас-спектрометра (TOF MS), використовуючи техніку висушених крапель та α-ціано-4-гідроксикоричну кислоту як матрицю. Всі аналізи були проведені з використанням Voyager-DE STR (Applied Biosystems) TOF MS, що працював у режимі відстроченої екстракції. Пептиди вимірювали в діапазоні мас від 750 до 4000 Да; всі спектри були внутрішньо відкалібровані та оброблені за допомогою програмного забезпечення Data Explorer. Білки були однозначно ідентифіковані шляхом пошуку всеосяжної бази даних про непотрібні білки за допомогою програми ProFound [41].

Аналізи поширення клітин