Межі у фармакології

Етнофармакологія

Редаговано
Айпін Лу

Гонконгський баптистський університет, Гонконг

Переглянуто
Ру Янь

Університет Макао, Китай

Раджендра Карки

Дитяча дослідницька лікарня Сент-Джуд, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

неферину

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Кафедра фармацевтичної біології, Інститут фармації та біохімії, Університет Майнца, Майнц, Німеччина
  • 2 Державна ключова лабораторія досліджень якості китайської медицини, Університет науки і технологій Макао, Макао, Китай

Вступ

Основними характеристиками раку є неконтрольований ріст і метастазування мутованих клітин, що в кінцевому підсумку призводить до смерті пацієнтів (Stratton et al., 2009). За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ) у 2012 році у всьому світі було зафіксовано близько 8,2 мільйона смертей та 14,1 мільйона вперше виявлених випадків раку. Згідно з повідомленнями Американського онкологічного товариства, в Сполучених Штатах, за повідомленнями Siegel et al., Прогнозується 1688 780 нових випадків раку та 600 920 смертей від раку. (2017). Примітно, що у слаборозвинених країнах спостерігається найбільша частота нових випадків захворювання (8,0 млн.) Та найвищий рівень смертності (5,3 млн.). Такі фактори ризику, як куріння, ожиріння та фізична бездіяльність, можливо, спричинять подальше збільшення випадків раку в майбутньому (Jemal et al., 2011).

Хіміотерапія є однією з основних схем лікування раку, яка часто проводиться одночасним введенням комбінованих схем різних засобів. Однак рівень успіху обмежений через лікарську стійкість пухлинних клітин та високу токсичність, пов’язану з лікуванням (Jabbour et al., 2009; Eintedar et al., 2013). Через важкі побічні ефекти хіміотерапевтичні препарати не можна вводити в дозах, достатньо високих для надійного усунення всіх пухлинних клітин в організмі, що призводить до вузьких терапевтичних показників.

На додаток до серйозної токсичності, МЛУ є основною проблемою відмови хіміотерапії. MDR характеризується перехресною стійкістю до багатьох структурно та механічно не пов'язаних протипухлинних препаратів (Gottesman and Ling, 2006; Gillet et al., 2007; Kuete et al., 2015). P-глікопротеїн (P-gp), кодований ABCB1/MDR1 ген регулюється в багатьох клінічно стійких та рефрактерних пухлинах і згадується як один з найважливіших механізмів розвитку МЛУ (Kuete et al., 2015). Надмірна експресія P-глікопротеїну (P-gp) пов'язана з прискореним відтоком хіміотерапевтичних засобів. Цей процес підживлюється АТФ як джерело енергії для здійснення витоку ліків. Орієнтація на P-gp та інші насоси для відтоку сімейства транспортерів ABC представляє перспективну стратегію відновлення МЛУ та підвищення ефективності хіміотерапевтичних препаратів (Abdelfatah and Efferth, 2015). З'ясування кристалічної структури мишачого P-gp (Aller et al., 2009) та розробка моделей гомології людського P-gp на основі мишачої амінокислотної структури дали цінну інформацію для кращого розуміння поліспецифічного зв'язування ліків при множинних конформаціях P-gp (Aller et al., 2009; Zeino et al., 2014; Kadioglu et al., 2016).

Намагаючись розробити нові препарати з більш високою специфічністю до пухлини та меншою токсичністю для нормальних тканин, природні продукти служать цінним джерелом (Newman and Cragg, 2012; Cragg and Newman, 2013). Біосинтез природних продуктів залежить або від еволюційної адаптації до навколишнього середовища, або як захисний механізм виживання організмів (Maplestone et al., 1992; Efferth et al., 2007). Вони можуть бути рослинного, тваринного, морського або мікроорганізмового походження. Біоактивність природних продуктів базується на припущенні, що вони володіють специфічною активністю щодо різних цільових білків (Venkatraman, 2010) Складним завданням фармакології є визначення цілей, пов'язаних із захворюваннями, які мають значення для терапевтичного втручання у пацієнтів (Cragg and Newman, 2013). Близько 75% затверджених протипухлинних засобів справді базуються на природних продуктах (Newman and Cragg, 2012; Cragg and Newman, 2013), що є сильним натяком на те, що природні продукти є перспективним резервуаром для розробки наркотиків.

Неферин - це алкалоїд бісбензилізохіноліну, виділений із зародків зеленого насіння Lotus (Nelumbo nucifera Гертн). Ця рослина споживається в Індії та Китаї з давніх часів. У традиційній китайській медицині він широко застосовується для лікування нервових розладів, безсоння, високої температури з неспокоєм, а також легеневих та серцево-судинних захворювань, таких як гіпертонія, атеросклероз, рестеноз та аритмія (Sridhar and Bhat, 2007; Jun et al., 2016; Шарма та ін., 2017). Різні дослідження вказували на потенційний протираковий ефект і неферину (Huang et al., 2011b; Yoon et al., 2013; Poornima et al., 2014; Xu et al., 2016). У цьому дослідженні ми оцінювали ефект неферину з точки зору інгібування P-gp через in silico молекулярне стикування, QSAR та в пробірці аналізи цитотоксичності та аналізи поглинання субстратів P-gp у стійких до ліків ракових клітинах.

Матеріали і методи

Культура клітин

Всі клітини були отримані з американської колекції типових культур (Rockville, MD, США), якщо не вказано інше. Таксол та стійкі до доксорубіцину типи ракових клітин MCF-7, A549 та HCT-8 були придбані у KeyGEN BioTECH, Китай. Всі середовища були доповнені 10% фетальною бичачою сироваткою та антибіотиками пеніциліном (50 Од/мл) та стрептоміцином (50 мкг/мл; Invitrogen, Пейслі, Шотландія, Великобританія). Усі культури клітин інкубували при температурі 37 ° C у 5% зволоженому інкубаторі CO2.

Аналізи цитотоксичності

Неферин розчиняли в ДМСО при кінцевій концентрації 100 ммоль/л і зберігали при -20 ° С перед використанням. Цитотоксичність оцінювали за допомогою аналізу 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолію броміду (МТТ) (5,0 мг/мл). Коротко, 4 × 10 3 клітини висівали на лунку в 96-лункові планшети перед лікуванням препаратом. Після культури протягом ночі клітини потім піддавали дії різних концентрацій неферину (0,039–100 мкмоль/л) протягом 72 год. Клітини без медикаментозного лікування використовували як контроль. Згодом до кожної лунки додавали МТТ (10 мкл) та інкубували при 37 ° С протягом 4 год з подальшим додаванням 100 мкл солюбілізаційного буфера (10% SDS у 0,01 моль/л HCl) та інкубацію протягом ночі. A570 нм визначали з кожної лунки наступного дня. Відсоток життєздатності клітин розраховували за такою формулою: Життєздатність клітин (%) = Atreated/Acontrol × 100. Дані були отримані в результаті трьох незалежних експериментів триплікації. Середнє значення представлено як ± SD. Значення IC50 отримують безпосередньо з перетину між кривою зростання та горизонтальною лінією при 50% життєздатності на графіку призми.

Молекулярна стиковка

Попередньо створена модель гомології людського P-gp (Tajima et al., 2014) була використана для досліджень молекулярного стикування за допомогою AutoDock 4 (Morris et al., 2009) на кишені, що зв’язує ліки. Залишками в кишені, що зв’язує ліки, були His61, Gly64, Leu65, Met69, Ser222, Leu304, Ile306, Tyr307, Phe336, Leu339, Ile340, Ala342, Phe343, Gln725, Phe728, Phe732, Leu762, Thr8379, I872, Thr945, Tyr953, Leu975, Phe978, Ser979, Val982, Gly984, Ala985, Met986, Gly989, Gln990 та Ser993 (Aller et al., 2009). Для охоплення цих залишків була обрана сітчаста карта. Три незалежні розрахунки стикування для неферину та R123 були проведені з 2 500 000 оцінками та 250 прогонами за допомогою генетичного алгоритму Ламарккіана. LBE та прогнозовані константи гальмування були отримані з файлів журналів стикування (dlg) та розраховані середні значення ± SD. Для візуалізації результатів стикування використовували візуальну молекулярну динаміку (VMD). Програмне забезпечення VMD було розроблено за підтримки NIH групою теоретичної та обчислювальної біофізики в Інституті Бекмена, Університет Іллінойсу в Урбана-Шампейн. Для розрахунків спільного стикування було обрано R123 та неферин для оцінки впливу сполученого з'єднання на енергію зв'язування та позу стикування.

QSAR та прогнозування токсичності

Програмне забезпечення Stardrop (Optibrium, Кембридж, Великобританія) було використано для оцінки властивостей лікарської здатності та токсичності неферину. Модуль ADME QSAR Stardrop був використаний для прогнозування властивостей лікарської здатності, тоді як модуль Дерека Нексуса був використаний для прогнозування токсичності. Модуль ADME QSAR допомагає передбачити широкий діапазон ADME та фізико-хімічних властивостей, використовуючи набір високоякісних моделей QSAR. Модуль Дерека Нексуса передбачає прогнозування ключових токсичних факторів на основі знань за допомогою даних з опублікованих та неопублікованих джерел. Дерек Нексус визначає взаємозв’язки між структурою та токсичністю сполук, передбачаючи потенційну токсичність. Він розрахував ймовірність сполуки, що викликає токсичність, на основі понад 40 кінцевих точок, включаючи мутагенність, гепатотоксичність та кардіотоксичність.

Результати роботи модулів ADME QSAR та Derek Nexus порівнювали з результатами роботи верапамілу. HBD, HBA, MW, logP, logD, TPSA, обертові зв’язки, HIA, hERG (калієвий канал) IC50 були обрані в якості дескрипторів лікарської здатності. Активність hERG має вирішальне значення для потенціалу серцевої дії, а блокада hERG пов’язана з серцевою аритмією та кардіотоксичністю. Параметри, що відповідають властивостям лікарської здатності, були позначені зеленим (донор Н-зв’язку по 5 клітин у кожній лунці та культивували протягом 24 год при 37 ° С в атмосфері, що містить 5% СО2. У місцях злиття клітини МДР інкубували з модулятором або без нього (10 мкМ верапамілу) та лікарський засіб (1, 2, 5 та 10 мкМ неферину) протягом 4 год при 37 ° C. Згодом у кожну лунку додавали 5 мкг/мл R123 і лунки інкубували ще 1 год при 37 ° C. Накопичення R123 зупиняли промиванням клітин п’ять разів крижаним PBS. Потім клітини ресуспендували в 400 мкл PBS для аналізу проточної цитометрії. Внутрішньоклітинну флуоресценцію вимірювали за допомогою проточного цитометра при довжині хвилі збудження 488 нм і довжина хвилі випромінювання 525 нм. Усі збір та аналіз даних проводили за допомогою CellQuest (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Каліфорнія, США), принаймні з трьома незалежними експериментами. Результати були показані як середнє значення інтенсивності флуоресценції.

Статистичний аналіз

Результати були виражені як середні значення ± SD, як зазначено. Різниця вважалася статистично значущою, коли стор-значення було менше 0,05. Студентська т-тестовий аналіз був використаний для порівняння між різними групами.

Результати

Аналіз цитотоксичності

Неферин давав значення IC50 у низькому мікромолярному діапазоні як для чутливих, так і для стійких клітинних ліній. Цікаво, що значення IC50 для стійких підліній були навіть нижче, ніж для чутливих клітинних ліній, явище, яке відоме як побічна чутливість (Saeed et al., 2013). Результати зведені на рисунку 1.

ФІГУРА 1. Цитотоксичність неферину щодо стійкого до паклітакселу та чутливого MCF-7 (A), стійкий до доксорубіцину і чутливий MCF-7 (B), стійкий до паклітакселу та чутливий A549 (C), стійкий до паклітакселу та чутливий HCT8 (D).

Проточна цитометрія

Неферин збільшує споживання R123 у всіх стійких до ліків клітинних лініях (стійкий до паклітакселу MCF-7, стійкий до доксорубіцину MCF-7 клітини раку молочної залози, стійкі до паклітакселу клітини раку легенів A549 та стійкі до паклітакселу HCT8 клітини раку товстої кишки) порівнянним чином, як це робив відомий інгібітор P-gp верапаміл. Навіть низькі концентрації (1 та 2 мкМ) дали порівнянне збільшення поглинання R123 у вигляді верапамілу (10 мкМ) у стійких до паклітакселу (рис. 2) або стійких до доксорубіцину клітинах MCF-7 (рис. 3). У стійких до паклітакселу клітинах A549 клітини 2, 5 та 10 мкМ неферину виявили порівнянне збільшення R123, ніж верапамілу (рис. 4). Низьких концентрацій неферину було достатньо для збільшення поглинання R123 у стійких до паклітакселу клітинах HCT8, порівнянних із верапамілом (рис.5).

РИСУНОК 2. Аналіз поглинання R123 неферину на стійких до паклітакселу клітинах MCF-7 раку молочної залози. (A) Представлені вихідні дані проточної цитометрії (B), поки (B) - кількісний аналіз цих даних проточної цитометрії. ∗∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗∗∗ стор Ключові слова: рак, хіміотерапія, лікарська резистентність, натуральні продукти, неферин, Р-глікопротеїн

Цитування: Kadioglu O, Law BYK, Mok SWF, Xu S-W, Efferth T та Wong VKW (2017) Аналіз режиму дії неферину, алкалоїду бісбензилізохіноліну Лотоса (Nelumbo nucifera) проти мультирезистентних пухлинних клітин. Спереду. Фармакол. 8: 238. doi: 10.3389/fphar.2017.00238

Отримано: 25 жовтня 2016 р .; Прийнято: 18 квітня 2017 р .;
Опубліковано: 05 травня 2017 р.

Айпін Лу, Гонконгський баптистський університет, Гонконг

Раджендра Карки, Дитяча дослідницька лікарня Сент-Джуда, США
Ру Янь, Університет Макао, Китай