Залежність від віку втрати та відновлення кісткової тканини під час розвантаження задніх кінцівок та подальшого перевантаження у щурів

Хейлі К. Каннінгем

1 Група випускників біомедичної інженерії, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

Даніель В. Д. Вест

2 Кафедра фізіології та мембранної біології, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

Леслі М. Баер

2 Кафедра фізіології та мембранної біології, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

Франклін Д. Тарк

3 Кафедра ортопедичної хірургії, Каліфорнійський університет, Медичний центр Девіса, Лоренс Дж. Еллісон, Дослідницький центр опорно-рухового апарату, 4635 2nd Avenue, Suite 2000, Сакраменто, Каліфорнія, 95817 США

Кіт Баар

1 Група випускників біомедичної інженерії, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

2 Кафедра фізіології та мембранної біології, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

4 Кафедра нейробіології, фізіології та поведінки, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

Сью К. Бодін

2 Кафедра фізіології та мембранної біології, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

4 Кафедра нейробіології, фізіології та поведінки, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

Блейн А. Крістіансен

1 Група випускників біомедичної інженерії, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, США

3 Кафедра ортопедичної хірургії, Каліфорнійський університет, Медичний центр Девіса, Лоренс Дж. Еллісон, Дослідницький центр опорно-рухового апарату, 4635 2nd Avenue, Suite 2000, Сакраменто, Каліфорнія, 95817 США

Пов’язані дані

Набори даних, використані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора на обґрунтований запит.

Анотація

Передумови

Структура та міцність кісток швидко втрачаються в умовах зниженого механічного навантаження, а старі кістки мають знижену здатність пристосовуватися до збільшеного механічного навантаження. Це турбує пацієнтів старшого віку, які переживають періоди обмеженої рухливості або постільного режиму, але гострі наслідки відсутності використання на кістках літніх пацієнтів докладно не описані. Попередні дослідження на тваринах насамперед вивчали вплив механічного розвантаження на молодих тварин. Ті, хто вивчав вікових тварин, зосереджувались виключно на втраті кісткової маси під час розвантаження, а не на відновленні кісток під час подальшої перезавантаження. У цьому дослідженні ми досліджували вплив зменшеного механічного навантаження та подальшого перевантаження на кістки за допомогою моделі розвантаження задніх кінцівок у дорослих (9 місяців) та вікових (28 місяців) самців щурів.

Методи

Тварин з обох вікових груп піддавали 14-денному розвантаженню задніх кінцівок з подальшим перевантажуванням до 7 днів. Додаткові старі щури піддавались 7-денному примусовому тренуванню на біговій доріжці під час перезавантаження або загальному 28-денному перезавантаженню. Трабекулярну та коркову кісткову структуру стегнової кістки визначали кількісно за допомогою мікро-комп’ютерної томографії ex vivo (μCT), а механічні властивості визначали кількісно за допомогою механічного тестування.

Результати

Ми виявили, що у дорослих щурів суттєво зменшилась об'ємна частка трабекулярної кістки (BV/TV) після розвантаження (- 27%), тоді як у вікових тварин після розвантаження не спостерігалася значної втрати кісткової маси. Однак у вікових тварин рівень трабекулярного BV/TV був нижчим після 3 днів перезавантаження (- 20% порівняно з вихідним рівнем), тоді як трабекулярний BV/TV дорослих щурів не відрізнявся від вихідних значень після 3 днів перезавантаження. Трабекулярний BV/TV вікових тварин залишався нижчим, ніж контрольні тварини, навіть при фізичному навантаженні протягом 7 днів перезавантаження та після 28 днів перезавантаження.

Висновки

Ці дані свідчать про те, що постаріла кістка менш реагує як на збільшене, так і на зменшене механічне навантаження, і що гострі періоди невикористання можуть призвести до тривалого дефіциту трабекулярної кісткової маси у людей старшого віку. Ці висновки вказують на необхідність терапевтичних стратегій для поліпшення здоров'я скелета пацієнтів похилого віку в періоди відсутності.

Передумови

Кістка зазнає значного і швидкого занепаду за структурою та міцністю за відсутності механічного навантаження [1–3]. Крім того, кістки людей похилого віку та тварин мають знижену здатність пристосовуватися до механічного навантажувального середовища [4, 5], роблячи фізичне навантаження або підвищене механічне навантаження менш ефективними при нарощуванні кісткової маси. Це особливо важливо для людей старшого віку, які зазвичай переживають періоди обмеженої рухливості або порушення роботи скелета у періоди хвороби або після травми чи операції; здатність цих суб'єктів відновлювати кісткову масу після періоду розвантаження може бути порушена.

Вплив механічного розвантаження на кістки широко вивчався як на людях, так і на моделях тварин. У людей тривалий період розвантаження значно зменшує об’єм і щільність кісткової тканини, як показано на підставі досліджень режиму постільного режиму та космічного польоту [2, 6, 7]. Наприклад, у жінок, які брали участь у 60-денному постільному режимі, зниження мінеральної щільності кісткової тканини (МЩКТ) у трабекулярній кістці стегнової та гомілкової кісток зменшилось на 3-4% [8]. Подібним чином астронавти, які проводили тривалий час у космосі, зазнавали 1-2% трабекулярної втрати МЩКТ у стегнах та хребті на місяць у космосі [9]. Подібним чином, ранні моделі вивантаження на мишах і щурах, включаючи дослідження космічного польоту та підвіску хвоста, виявили, що об'єм трабекулярної та коркової кісток швидко втрачається під час періодів відсутності [2, 10–13]. Повідомлялося про втрати 20–50% об’єму трабекулярної кістки в проксимальній частині гомілки після двох тижнів розвантаження задніх кінцівок у дорослих щурів [11, 14]. Крім того, довші напади розвантаження (28 днів) призвели до невеликих (

5%) зменшується МККТ корка [13, 15]. Незважаючи на те, що вплив механічного розвантаження на кістку було ретельно досліджено, було порівняно мало досліджень щодо структурного відновлення кістки під час перезавантаження та факторів, що впливають на це відновлення. Деякі дослідження, що вивчають перезавантаження, показали, що для повного відновлення МЩКТ необхідний період перезавантаження, що вдвічі перевищує період розвантаження [13, 16]. Крім того, у щурів спостерігали, що, хоча об’єм кістки під час перезавантаження повертається до контрольних рівнів, у кістках все ще менше остеобластів і нижча швидкість формування кісток [11].

Вплив механічного розвантаження на застарілу кістку недостатньо добре встановлений ні на людях, ні на моделях тварин. У дослідженнях космічних польотів людини найчастіше беруть участь здорові молоді чоловіки [6, 7], і існує мало досліджень режиму постільного режиму за участю літніх пацієнтів, більшість з яких досліджували вплив на м’язи, а не на кістки [17, 18]. На моделях на тваринах мало досліджень досліджували роль віку в адаптації кісток до розвантаження [12], а вплив віку на реакцію перезавантаження ніколи не досліджувався. Більшість досліджень на гризунах використовували або молодих скелетно незрілих тварин (щурів віком 5–7 тижнів) [2, 11, 19], або молодих дорослих тварин (щурів 4–6 місяців) [13, 15, 20]. Було висловлено припущення, що кістка старих щурів може взагалі не реагувати на короткі напади розвантаження [12], однак це базується на одному дослідженні, і не проводилось обстеження вікових тварин під час більш тривалих нападів розвантаження чи перевантаження, щоб вивчити довгострокові ефекти. Тому невідомо, чи вікова кістка абсолютно не реагує на механічне розвантаження, чи є затримка адаптаційної реакції на механічне розвантаження, і якою мірою зістарена кістка може відновитись від будь-якої втрати кісткової тканини під час перевантаження.

Методи

Тварини

У цьому дослідженні використано загалом 63 самці щурів Фішер 344 х Браун-Норвегія (FBN-F1) з Національної інституції старіння (NIA) Колонія гризунів (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Щурам було або 9 місяців («Дорослий», n = 23), або 28 місяців («У віці», n = 40). Усі щури були розміщені індивідуально. Доглядали за щурами відповідно до рекомендацій, встановлених Національним інститутом охорони здоров’я (NIH) щодо догляду та використання лабораторних тварин. Усі процедури були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при UC Davis.

Експериментальні групи та навчальний дизайн

залежність

Експериментальний дизайн. Для цього дослідження використовували дорослих (9-місячних) та вікових (28-місячних) щурів (n = 63). Базові щури були евтаназовані на 0. день. Решта груп пройшли 14-денне розвантаження задніх кінцівок, причому група щурів була евтаназована відразу після розвантаження задніх кінцівок. Усім рештам щурів повернули нормальну активність у клітці. Щурів з обох вікових груп евтаназували через 3 або 7 днів перезавантаження. Додаткова група старілих щурів була евтаназована через 7 днів перезавантаження за допомогою приуроченої бігової доріжки. Дві додаткові групи вікових щурів були евтаназовані через 28 днів перезавантаження або в еквівалентному віці для контролю за віковими збігами (не піддавались розвантаженню задніх кінцівок)

Розвантаження задніх кінцівок через хвостову підвіску

Щурів піддавали розвантаженню задніх кінцівок через хвостову підвіску, як спочатку описано Морі-Холтеном [1]. Коротко кажучи, шкіру хвоста очищали за допомогою спиртової прокладки, висушували, а потім обприскували легким покриттям настойки бензоїну. Потім у довжину хвоста смужку Skin-Trac обмотували навколо металевого бруска і накладали на дві сторони хвоста. Хвіст обмотували самоклеючою пов’язкою Medi-Rip LF, а потім тварину підвішували, прикріпивши металеву планку до поворотного гачка над кліткою для підвіски. Висоту гачка регулювали таким чином, щоб лише передні кінцівки могли торкатися дна клітки. Щури могли вільно обертатися в усіх напрямках у своїй клітці і мали вільний доступ до їжі та води. Ваги тіла щурів брали перед суспензією і контролювали протягом усього періоду розвантаження. Після розвантаження або перезавантаження щурів евтаназували, а задні кінцівки збирали і зберігали в 70% етанолі перед аналізом. Попередні дослідження показали, що зберігання кісток у етанолі мало впливає на механічні властивості кістки, якщо вона правильно регідратована перед тестуванням [21, 22].

Активність у клітці

Перед розвантаженням та під час перезавантаження активність клітини дорослих та вікових щурів вимірювали за допомогою системи активності фотопроменя Home Cage (San Diego Instruments). Кожного щура розміщували індивідуально, а активність відстежували протягом 12-годинного темного циклу та протягом першої години світлового циклу. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення Photobeam Activity System.

Мікрокомп’ютерний томографічний аналіз трабекулярної та коркової кісток

Стегна сканували за допомогою мікро-комп’ютерної томографії (μCT 35, Brüttisellen, Швейцарія), щоб проаналізувати морфологічні зміни в трабекулярній та корковій кістках під час розвантаження та перезавантаження. Кістки сканували з потенціалом рентгенівської трубки 55 кВп, інтенсивністю 114 мА, часом інтеграції 900 мс, ізотропним номінальним розміром вокселя 15 мкм. Трабекулярний аналіз кісток проводили при дистальному метафізі стегнової кістки на ділянці 200 зрізів (3 мм), починаючи безпосередньо поруч із дистальною пластиною росту стегна. Об'ємну частку трабекулярної кістки (BV/TV), трабекулярне число (Tb.N), товщину трабекулярного покриву (Tb.Th), трабекулярне розділення (Tb.Sp) та інші структурні параметри розраховували за допомогою програмного забезпечення 3D-аналізу виробника. Коркова кістка була проаналізована за допомогою 200 зрізних (3 мм) об'ємів, що представляли інтерес, з центром у 25, 50 та 75% довжини діафізу. Площа кісток (B.Ar), загальна площа поперечного перерізу (T.Ar), товщина кори (C.Th), максимальні та мінімальні моменти інерції (Imax та Imin) та інші структурні параметри були розраховані за допомогою 3D-аналізу виробника програмне забезпечення.

3-точкове механічне випробування на вигин

Після візуалізації μCT стегно було механічно випробувано на триточкове згинання за допомогою системи тестування матеріалів (ELF 3200, TA Instruments, New Castle, Делавер) для визначення структурно-механічних властивостей кісткової кістки. Стегнові кістки занурювали у забуференний фосфатом сольовий розчин щонайменше на 10 хв перед тестом для регідратації кісткової тканини в ізотонічному розчині. Виміряли та позначили середню точку кожної стегнової кістки, і кожну пробу помістили в 3-точковий згинальний пристрій таким чином, щоб середня точка кістки знаходилася безпосередньо під вантажним валиком. Дві нижні площини були розташовані на відстані 13 мм, і кістки випробовували з натягом заднього аспекту кістки. Одноманітне монотонне навантаження на руйнування застосовувалося при повільній (квазістатичній) швидкості навантаження 1 Н/сек. Дані сили та переміщення реєстрували на частоті 100 Гц. З отриманих даних про зміщення зусилля границя текучості була візуально визначена як точка, в якій закінчувалася лінійна частина кривої. З цих даних визначали жорсткість на вигин (K), силу текучості (Fy) та граничну силу (Fult). Геометрію кісток, визначену за допомогою сканування μCT, використовували для розрахунку модуля вигину (E), межі текучості та граничної напруги.

Метафізична компресія трабекулярної кістки