Вплив впливу, дієти та терморегуляції на показники глюкокортикоїдів у фекаліях диких ведмедів

Філія Sinopah Wildlife Research Associates, штат Міссула, штат Монтана, Сполучені Штати Америки

впливу

Поточна адреса: New England Aquarium, Бостон, штат Массачусетс, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ біології, Вашингтонський університет, Сіетл, Вашингтон, Сполучені Штати Америки

Науковий центр Північних Скелястих гір, Геологічна служба США, Західний льодовик, Монтана, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ біології, Вашингтонський університет, Сіетл, Вашингтон, Сполучені Штати Америки

  • Джефф Штец,
  • Кетлін Хант,
  • Кетрін К. Кендалл,
  • Семюель К. Вассер

Цифри

Анотація

Цитування: Stetz J, Hunt K, Kendall KC, Wasser SK (2013) Вплив впливу, дієти та терморегуляції на показники глюкокортикоїдів у фекаліях диких ведмедів. PLoS ONE 8 (2): e55967. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055967

Редактор: Френк Сібахер, Університет Сіднея, Австралія

Отримано: 1 жовтня 2012 р .; Прийнято: 4 січня 2013 р .; Опубліковано: 14 лютого 2013 року

Це стаття з відкритим доступом, вільна від усіх авторських прав, і може бути вільно відтворена, розповсюджена, передана, модифікована, побудована або використана будь-ким в будь-яких законних цілях. Робота доступна під присвятою Creative Commons CC0 у відкритому доступі.

Фінансування: Польові роботи для цього дослідження в основному фінансували JBS, але жоден автор не отримав жодної потенційної фінансової вигоди завдяки цій роботі. USGS надав офісні приміщення, ІТ-підтримку та польовий транспорт. Всі лабораторні аналізи були підтримані Центром збереження біології Університету Вашингтона. Додаткову лабораторну підтримку надав Університет Монтани. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Відповідно до політики PLOS ONE щодо документування конфлікту інтересів, автори заявляють, що немає жодних конкуруючих інтересів з авторами. Зокрема, автор, пов’язаний із приватною організацією (JBS), не має жодних інтересів у жодному із методів чи результатів, включених до цього рукопису. Таким чином, авторські зв'язки не змінюють дотримання авторами всіх положень PLOS ONE щодо обміну даними та матеріалами.

Вступ

Аналіз калових гормонів став широко використовуваною методикою вимірювання ендокринного статусу тварини і може надати цінну інформацію програмам збереження та моніторингу. Зразки калу часто легко знайти та ідентифікувати за видовим рівнем, і їх можна збирати, не турбуючи дику природу [1]. Аналіз гормонів у цих зразках може забезпечити різноманітні міри стресу, репродуктивного та метаболічного статусу, які можуть співвідноситися з тиском навколишнього середовища з часом [2] - [10]. Однак неінвазивний збір зразків часто включає зразки, які зазнавали змінних умов середовища протягом різних і невідомих періодів часу. Розуміння того, як час і вплив у природному середовищі впливають на деградацію гормонів, є необхідною умовою надійної інтерпретації рівня гормонів у калі, особливо якщо однакові природні умови, що викликають різницю в рівні гормонів (наприклад, температура навколишнього середовища), також сприяють деградації гормонів [11], [12 ].

Ми відокремлюємо терморегуляцію від ефектів деградації на рівні fGC у дослідженні ведмедів-гризлі (Ursus arctos horribilis) та американських чорних ведмедів (U. americanus) у Національному парку льодовика, штат Монтана. Дата Юліана (оцінка температури навколишнього середовища) плюс аспект, нахил та висота (колективна оцінка теплового впливу) та кількість опадів у місцях збору зразків використовувались для прогнозування впливу терморегуляції шляхом вимірювання рівнів fGC у свіжих зразках калу в момент часу 0 (тобто зразки Рисунок 1 Карта, що показує місце розташування обстежених стежок та скатів, зібраних у Національному парку Льодовик, Монтана.

Скати були зібрані протягом 09 вересня - 11 жовтня 2001 року.

Район дослідження був розташований на захід від континентального розділення, у відносно вологому кліматі, що відображає морський вплив. Висота становила приблизно від 950 м до 1250 м. Обстежувані стежки проходили переважно на схилах до західних або південних схилів через зрілий ліс, що складається здебільшого з дугласової ялиці (Pseudotsuga menziesii), ялини Енгельмана (Picea engelmannii), соснової ложі (Pinus contorta) та західної модрини (Larix occidentalis).

Хоча ВНП забезпечує високий рівень захисту дикої природи в її межах, відомо, що ведмеді легко пересуваються за межі парку та через американський шосе 2/залізничний коридор. За межами ВНП ведмеді піддаються різноманітним стресовим факторам, пов’язаним з діяльністю людини, такою як рух поїздів та шосейних доріг, приватні резиденції та невеликі громадські будинки, а також різні види рекреаційної та промислової діяльності на відкритому повітрі, такі як вирубка лісу.

Збір та обробка зразків

Період дослідження був з юліанської дати 250 (початок вересня), коли денні температури були від 27 ° до 35 ° C, і до юліанської дати 300 (кінець жовтня), коли температури були близько до нуля, приблизно. Від 0 ° до -5 ° C (рис. 2). Щодня обстежували дві стежки довжиною приблизно 19 км, щоб переконатись, що кожен новий виявлений розкид був Рисунок 2. Зміна високої та низької температури (° С) за період відбору проб у Західному льодовику, штат Монтана, 2001 р.

Коли свіжий розкид (. Таким чином, +1 є найгарячішим аспектом (на захід) та -1 (на схід від NE) найкрутішим. Ми використовували географічну інформаційну систему для усереднення аспекту через кожні 30 м пікселя, який перетинав 100 м буфер навколо місцезнаходження кожного зразка. Аспект був би важливим, якщо ведмеді шукатимуть та змагатимуться за ці місця для кращого регулювання теплових вимог. Наш метод передбачає, що розташування зразків калу є розумним проксі середнім місцем розташування ведмедя. Будь-яка випадкова помилка, пов’язана з цим припущенням, повинна швидше зменшуватися ніж збільшити значення коваріатів у нашій моделі.

Всі зразки калу висушували ліофілізацією протягом 30 днів після збору та зберігали при -80 ° C до вилучення та аналізу на концентрацію глюкокортикоїдів. В інших всеїдних було показано, що зразки сублімаційного сушіння та вміст гормону, що виражається на г сухого калу, мінімізують вплив дієти на швидкість виведення фекальних гормонів, незалежно від харчування [12].

Всі зразки витягували та аналізували на fGC, використовуючи метод, описаний Wasser et al. [9]. Коротко, 0,2-пробну підсумку висушеної, подрібненої в порошку, добре перемішаної проби зважували з точністю до 0,0001 г і переносили у флакон об'ємом 15 мл. Після додавання 4 мл 90% метанолу до зразка, флакон закупорювали і потім струшували протягом 30 хв у пульсуючому вихорі. Потім зразки центрифугували (20 хв) і 1 мл супернатанту видаляли на зразок і зберігали при -20 ° C до аналізу. Потім екстракти розбавляли в чотири рази в буфері для аналізу та кількісно визначали для fGC подвійним набором для радіоімуноаналізу 125 I антитіла (MP Biomedicals [раніше ICN], Solon, OH, каталог № 07-120103). Ми використовували протокол виробника, окрім половинних обсягів. Низький і високий контроль були включені в кожен аналіз. Неспецифічні зв’язувальні пробірки та заготовки аналізували в чотирьох примірниках, а стандарти, контролі та зразки - у двох примірниках; будь-яку пробу з CV> 10% між дублікатами повторно аналізували для підтвердження результатів. Цей аналіз був попередньо підтверджений для fGC чорного та ведмедя грізлі [9]. Інші деталі аналізу див. У Wasser et al. [9] та Хант та Вассер [11].

Статистичний аналіз

Виміри глюкокортикоїдів у фекаліях нормалізували шляхом log-трансформації (log10 (X + 1)) у всіх аналізах. Ми використовували узагальнені лінійні моделі (GLM) для спочатку прогнозування концентрацій fGC у свіжих зразках (час 0) на основі даних про харчування (ягоди та м’ясо> рослинність [24]), температури навколишнього середовища (дата Юліана; рис. 1) та теплового впливу (наприклад, аспект, нахил, висота та індекс теплового навантаження). Вважалося, що ефекти деградації були незначними за час зразків 0 (вік ≤24 год), оскільки попередня робота [11] показала, що ГХ у ведмежому розсіюванні є дуже стабільними. Ми знайшли підтримку цього припущення, показавши, що опади (від часу дефекації до збору зразків) не впливали на концентрації fGC у зразках часу 0 після виявлення опадів, які є основною причиною деградації у зразках часу 1 (див. Результати). Коваріати з часу 0 GLM були використані для прогнозування концентрацій fGC у відкритих половинах зразка, щоб визначити, чи ті самі екологічні коваріати все ще надійно прогнозують концентрації fGC, з урахуванням впливу часу впливу та опадів. Всі змінні, включені в наші остаточні моделі, були отримані з двох окремих GLM, підтримка яких базувалася на значеннях AICc [25].

Потім усі значущі змінні в цих двох GLM були включені в багатовимірний дисперсійний аналіз дисперсії (MANOVA) для виявлення змінних середовища, які впливали як на варіацію fGC між зразками (незалежно від часу впливу), так і на ефекти деградації в межах зразка. час контакту. Це дозволило нам визначити, чи були наслідки деградації достатньо сильними протягом перших 1 проб (тобто, половини зразків, які залишали в полі протягом 1–28 днів), щоб замаскувати різницю в рівнях ФГК через екологічні стресові фактори, виявлені за час 0 (свіжий ) підпроби.

Розмір ефекту також вивчався в аналізі MANOVA, щоб порівняти цілі моделі, а також усі змінні, включені в кожну модель, використовуючи статистику Коена, де:

За домовленістю розміри ефектів 0,02, 0,15 та 0,35 називаються відповідно малим, середнім та великим.

Результати

Аналіз 1: Фактори, що впливають на рівні fGC у часі 0

Основними ефектами, що пояснюють зміну концентрацій fGC у момент часу 0 (тобто до ефектів деградації), на основі підтримки моделі AICc, були вміст їжі (рослинність проти ягід чи м’яса), юліанська дата, аспект, а також взаємодія між фініковими датами та аспект (таблиця 1). Час 0 фГК збільшувався з юліанською датою, найнижчим у попередні дати (тепліші температури) та найвищим у пізніші дати (холодніші температури; рис. 2). Однак взаємодія з аспектом показало, що fGC були найнижчими в більш прохолодних аспектах у більш ранні терміни (більш високі температури), і в теплих аспектах у більш пізні терміни (холодніші температури). По суті, fGC були нижчими для скатів, зібраних у прохолодних місцях (аспекти) під час спекотної погоди та в теплих місцях під час холодної погоди (рис. 3).

Кожен рядок відображає іншу дату Джуліана з інтервалом у 20 днів, як показано пунктирною вертикальною лінією в центральній колонці кожного рядка. Аспект трансформується, завдяки чому −1 = найкрутіший та +1 = найтепліший аспект (див. Текст).

ФГК за час 0, здається, також відображав харчові якості дієти; fGC були найвищими для скатів, що містять переважно рослинність (трава, листя, стебла, коріння, бульби та клубнелуковиці, імовірно, це свідчить про відносно погане харчування та/або високий стрес), а найнижчими для скатів, що містять ягоди та м'ясо (маючи на увазі відносно хороше харчування та/або низький рівень стрес; Таблиця 1).

Як і очікувалось, опади не впливали на концентрації fGC у зразках часу 0, підтверджуючи наше припущення, що ефекти розкладання були не виявлені в пробах часу 0 (Таблиця 1).

Аналіз 2: Фактори, що впливають на рівні fGC у часі 1

Ми досліджували стабільність fGC з часом, оцінюючи, чи залишаються значущими ті самі змінні, що передбачають концентрації fGC у зразках часу 0, у зразках часу 1, з додаванням або без додавання всіх заходів деградації (наприклад, часу впливу, опадів та їх взаємодії з аспектом ). Всі провісники fGC в пробі часу 0 залишалися значущими прогностиками в пробах часу 1. Однак додавання опадів та їх взаємодія з аспектом значно покращило модель прогнозування концентрацій fGC у зразках часу 1 (Таблиця 1). Збільшення кумулятивних опадів між часом 0 та часом 1 зменшувало концентрації fGC у зразках часу 1 і чим холодніше було, тим більше цей ефект посилювався.

Аналіз 3: Коваріати, що впливають на деградацію ГХ

Повторні заходи MANOVA узгоджувались із вищезазначеними висновками (Таблиця 2). Дієта, дата Джуліана та взаємодія між датою Джуліана та аспектом залишалися важливими предикторами варіацій між fgc між зразками. Кумулятивні опади, які суттєво впливали на концентрації fGC у зразках часу 1, але не в часі 0, також були значущим предиктором варіації fGC між зразками в MANOVA. Однак лише дієта та взаємодія між кумулятивними опадами та аспектом були суттєвими предикторами коливань у вибірці з часом. Кумулятивні опади у зразках, які опромінювались у більш прохолодних аспектах, показали підвищену деградацію з часом (Таблиця 2).

Обговорення

Можливо, частина дисперсії між вибірками у fGC, що пояснюється датою Джуліана, також була обумовлена ​​сезонними змінами в раціоні, оскільки харчові важливі ягоди були найбільш поширені раніше в сезон відбору проб, коли fGC був найнижчим. Однак такі харчові ефекти не можуть пояснити взаємодію між Джуліанською датою та аспектом на fGC; їх можна примирити лише завдяки спільному впливу температури та впливу. Крім того, скат мішав високоякісні та низькоякісні продукти харчування протягом усього сезону відбору проб. Наприклад, надзвичайно поживні ягоди були основним вмістом деяких порід ще в середині жовтня.

Деяка деградація ФГК відбувалась протягом 28-денного періоду експозиції, в основному за рахунок кумулятивних опадів, особливо в більш прохолодних аспектах, де випаровування було б зменшено. Загалом, fGC зменшився за час зразків 1 як функція аспекту взаємодії з опадами. Однак у часі 0 зразків ця залежність була змінена; fGC збільшився в часі на 0 зразків, коли аспект взаємодіяв з юліанською датою (холодні температури), незважаючи на більшу кількість опадів у пізніші юліанські дати. Ці різні взаємозв'язки між зразками часу 0 та часу 1 суттєво підтверджують наші висновки, що (a) fGC відображає вимоги до терморегуляції та (b) про те, що деяка деградація fGC дійсно відбувається у зразках, що піддаються кумулятивному випаданню опадів протягом тижнів до збору. Однак ці останні ефекти все ще були недостатніми, щоб замаскувати ефекти біологічних коваріатів, що передбачають концентрації fGC у зразках часу 1.

Нарешті, автокореляція вимірювань fGC навряд чи сприятиме результатам дослідження, оскільки декілька зразків були зібрані в безпосередній близькості один від одного лише в одному випадку (рис. 1). У майбутніх польових дослідженнях генотип Scat може бути додатковим захистом проти автокореляції, як це зробили Wasser et al. [1].

Висновки

Скат може надати широкий спектр фізіологічної та генетичної інформації і є найбільш доступним біологічним продуктом з дикої природи в природі. У сукупності це надає можливість розділити впливи від ряду різноманітних впливів навколишнього середовища за умови правильної конструкції дослідження [5], [10]. Наші результати свідчать про те, що аналізи fGC можуть дати уявлення про терморегуляцію та живлення ведмедів-грізлі та чорних ведмедів, а також можуть служити показником фізіологічної реакції на кліматичні зміни. Далі ми показали, що деякі наслідки деградації зразків мають місце у дикій природі. Однак цих ефектів було недостатньо, щоб замаскувати виявлення біологічних впливів на навколишнє середовище на урсидів у зразках, що експонувались протягом одного місяця. Незважаючи на це, контроль кумулятивних опадів протягом періоду експозиції зразка може бути використаний як додатковий запобіжний засіб проти таких наслідків деградації, що маскують біологічні ефекти. Подібні дослідження, що вивчають інші гормони, середовища, дієти та види, будуть важливими для оцінки того, наскільки наші узагальнення можна узагальнити.

Подяка

Ми дякуємо нашим технікам на місцях Л. Еріксону, Дж. Геберту, Дж. Массії, Д. Редінгу, Б. Волленцієну та К. Йелю за те, що вони щодня протягом 6 тижнів проходили одну і ту ж стежку незалежно від погоди чи нудьги. Ми вдячні Дж. Реймерсу з Університету Монтани за доступ та допомогу з ліофілізацією зразків. Ми вдячні Ліз Аддіс за допомогу в лабораторних дослідженнях та аналізі даних. Ми вдячні Тайлеру Коулману, Клейтону Міллеру та двом анонімним рецензентам за надання корисних коментарів щодо ранніх чернеток цього рукопису. Це дослідження було проведено в рамках колекції Національного парку Льодовик GLAC-2001-SCI-0024.

Внески автора

Задумав і спроектував експерименти: JS SW. Виконував експерименти: JS KH SW. Проаналізовано дані: JS KH SW. Внесені реагенти/матеріали/інструменти для аналізу: JS KH KK SW. Написав папір: JS KH KK SW.