Межі в ендокринології

Клінічний діабет

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Метформін: Поза діабетом Переглянути всі 12 статей

Редаговано
Грем Рена

Університет Данді, Великобританія

Переглянуто
Елісон Д. Макнейлі

Університет Данді, Великобританія

Юань Чжоу

Пекінський університет, Китай

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

метформіну

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Ключова лабораторія провінції Гуандун, головний мозок і поведінка мозку, Інститут пізнання мозку та хвороби мозку (BCBDI), Шеньчженьські інститути передових технологій, Китайська академія наук, Шеньчжень, Китай
  • 2 Шеньчженьська ключова лабораторія респіраторних хвороб, Шеньчженьська ключова лабораторія патогенних мікроорганізмів та стійкості до бактерій, кафедра медицини органів дихання та критичної допомоги, Шеньчженьський інститут респіраторних захворювань, Шеньчженська народна лікарня, Перша афілійована лікарня Південного науково-технічного університету, Другий клінічний медичний коледж університету Цзінань, Шеньчжень, Китай

Вступ

Зростаюча епідемія ожиріння вимагає більших зусиль для визначення нових терапевтичних цілей/стратегій для лікування цього метаболічного розладу. Патогенні фактори ожиріння розширилися від генетичного фону та ендокринних факторів до центрального нервового контролю, включаючи ненормальну поведінку годування та прямий нейронний контроль фізіології жирової тканини (1, 2). За останні кілька десятиліть було досягнуто значного прогресу; однак для вирішення питань, що стосуються цього розладу, потрібні додаткові дослідження.

Метформін (диметилбігуанід) став першим препаратом для зниження рівня глюкози в крові для пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу (T2DM) (3, 4). У пацієнтів з T2DM, які також страждають ожирінням, метформін також відіграє клінічну роль при ожирінні (5, 6). Детальний функціональний механізм його дії при ожирінні потребує подальшого дослідження. Метформін отримують з галегіну, природного продукту середньовічного європейського рослинного рослини Galega officinalis. Створений як безпечна та ефективна терапія, метформін має безліч способів дії, і його молекулярні механізми не повністю розшифровані, незважаючи на його клінічне використання протягом 60 років (3, 4, 7). Однією з основних молекулярних мішеней метформіну є клітинний енергетичний сенсор Аденозинмонофосфат (АМФ), активована протеїнкіназа (АМФК) (7, 8). Окрім печінкового глюконеогенезу, для метформіну були виявлені накопичувальні тканини/органи-мішені, включаючи білу та коричневу жирову тканину (9), легені (10) та центральну нервову систему (11).

Хоча відомо, що він має досвід у генетичних та екологічних факторах, однією з прямих причин ожиріння залишається дисбаланс між споживанням та витратою калорій. У цьому дослідженні була використана модель миші з високим вмістом жиру (HFD). Зважаючи на хронічні характеристики та складність енергетичних витрат, ми зосередили увагу на ранній фазі годування HFD щодо збільшення маси тіла. Таким чином, лікування HFD тривало протягом 3 тижнів. Беручи до уваги сучасні наслідки зміни кишкових бактерій як при ожирінні (12), так і при лікуванні метформіном діабету (13), також були досліджені зміни мікробіоти кишечника при короткочасному спільному лікуванні HFD та метформіну. Крім того, можливі наслідки СНЧ на центральну нервову систему оцінювали за допомогою тесту поведінки, що рухається вільно, в лабіринті з підвищеним плюсом (EPM) та тесті на відкритому полі (OFT). Беручи до уваги повідомлення про активацію шляху AMPK метформіном, імунозабарвлення фосфо-AMPK проводили в WAT та мозку.

Матеріали і методи

Дорослих (6 тижнів) самців мишей C57BL/6J (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. China) розміщували в групах, отримуючи доступ до харчових гранул і води ad libitum, і підтримується на 12: 12-годинному циклі світла/темряви. Усі методи вирощування та експериментальні роботи у цьому дослідженні були схвалені комітетами з догляду та використання тварин Шеньчженьського інституту передових технологій (SIAT) Китайської академії наук (CAS), Китай.

Дієта з високим вмістом жиру (HFD), нормальна дієта (ND) та лікування метформіном

Три групи мишей були піддані різному лікуванню: одна група отримувала нормальний раціон (ND); одна група отримувала дієту з високим вмістом жиру (HFD); а третя група отримувала дієту HFD та спільне лікування метформіном через пероральний введення (300 мг/кг/день, Sigma-Aldrich, BP227, Сент-Луїс, Міссурі). Фізіологічний розчин вводили групам ND та HFD через пероральний манометр. Для HFD 60% енергії отримували з жиру, тоді як у Північній Америці 10% енергії отримували від жиру (Trophic Animal Feed High-Tech, Китай; TP23300 для HFD, TP23302 для ND). Формула HFD була такою: казеїн (267 г/кг), мальтодекстрин (157 г/кг), сахароза (89 г/кг), соєва олія (33 г/кг), олія сало (301 г/кг), целюлоза (67 г/кг), мінеральна суміш M1020 (66 г/кг), вітамінна суміш V1010 (13 г/кг), L-цистин (4 г/кг), білітрат холіну (3 г/кг), TNHQ ( 0,067 г/кг).

Всі процедури тривали 3 тижні. Збільшення маси тіла реєстрували для кожної миші щодня до 21-го дня. Вранці 21-го дня реєстрували масу тіла мишей, відбирали зразки калу, а потім мишей піддавали тесту на підвищений плюс лабіринт (EPM). На 22 день було проведено випробування на відкритому грунті (OFT), після чого мишей глибоко знеболили і померли. Білі жирові тканини епідидиму та мозок від трьох мишей кожної групи були піддані подальшому гістологічному дослідженню. Зразки калу мишей збирали у стерильні пробірки, заморожували швидко, а потім зберігали при -80 ° C до дня аналізу.

Гістологічне дослідження

Перебуваючи під глибокою анестезією, мишам перкардировали перфузію 4% параформальдегіду (PFA) у PBS, епідидимальні білі жирові тканини (WAT) та мозок збирали та фіксували в 4% PFA. Зразки тканини WAT вкладали у парафін, а зрізи 4 мкм вирізали на мікротомі. Зрізи піддавали фарбуванню гематоксиліном та еозином (H&E) для морфологічного дослідження та імунного флуоресцентного фарбування для фосфо-AMPK (pAMPK). Для аналізу розміру адипоцитів вимірювали довший діаметр кожного адипоцита. Щоб уникнути кластерного аналізу, показники однієї миші спочатку усереднювались і використовували його середнє значення як єдине значення для подальшого порівняння між різними групами лікування. Для оцінки збільшення адипоцитів було розраховано середнє значення всіх підрахованих адипоцитів, а адипоцит із більшим діаметром, ніж середнє значення всіх клітин, виміряних у групі ND, визначено як «Великий адипоцит». Кількість і відсоток великих адипоцитів розраховували як параметр збільшення адипоцитів.

Крім того, мозок, зібраний після фіксації 4% PFA, кріозахищений в 30% сахарозі в PBS і розрізаний на кріостаті зрізами 30 мкм. Для картографування експресії pAMPK у мозку проводили імуногістохімію. Фарбування антитіл проводили на плаваючих ділянках тканини з однією лункою. Зрізи інкубували протягом 24 годин у первинних антитілах при 4 ° C з наступною інкубацією протягом ночі з вторинними антитілами при 4 ° C. Основним антитілом, яке використовували, був кролячий анти-pAMPK (№2535, Cell Signaling Technology; 1: 50). Для виявлення різних флуоресцентних кольорів були обрані відповідні вторинні антитіла. Для протизабарвлення зрізи інкубували протягом 10 хв з 40, 6-діамідин-2-феніліндолом (DAPI, 0,4 мг/мл, Sigma). Всі зображення були зроблені за допомогою конфокального мікроскопа Zesis LSM 880 або системи віртуального мікроскопічного сканування Olympus VS120.

Екстракція ДНК, секвенування та аналіз регіону V4 рибосомної РНК V4

Екстракція ДНК здійснювалась згідно з інструкціями виробника - MOBIO PowerSoil ® Комплект для ізоляції ДНК 12888-100. ДНК зберігали при -80 ° C у буферному розчині Tris-EDTA. Щоб забезпечити ампліфікацію області V4 гена 16S рРНК і додати послідовності штрих-кодів, були розроблені унікальні зливні праймери на основі універсального набору праймерів, 515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3 ′) і 806R (5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3 ′), а також послідовності штрих-кодів. Суміші ПЛР містили 1 мкл кожного прямого та зворотного праймерів (10 мкМ), 1 мкл матричної ДНК, 4 мкл dNTP (2,5 мМ), 5 мкл 10 × буфера EasyPfu, 1 мкл ДНК-полімерази Easy Pfu (2,5 U/мкл), і 1 мкл подвійно дистильованої води в загальному реакційному об'ємі 50 мкл. Тепловий цикл складався з початкової стадії денатурації при 95 ° С протягом 5 хв, після чого 30 циклів денатурації при 94 ° С протягом 30 с, відпалу при 60 ° С протягом 30 с і розширення при 72 ° С протягом 40 с, кінцевий крок розтягування при 72 ° C протягом 4 хв. Очікуваний розмір смуги для 515f-806r становить

300–350 bp перевіряють агарозним гелем. Кількісно визначте амплікони за допомогою набору для аналізу dsDNA Quant-iT PicoGreen (ThermoFisher/Invitrogen cat. No P11496). Бібліотеку ампліконів для високопродуктивної послідовності на платформі Illumina MiSeq фірми Promegene, Китай, поєднували в однаковій кількості та згодом кількісно визначали (KAPA Library Quantification Kit KK4824) відповідно до інструкцій виробника. Використовуючи конвеєр 1 «Кількісне уявлення про екологію мікроорганізмів» (QIIME) 1.8.0, необроблені послідовності оброблялись для об’єднання зчитувань у теги відповідно до взаємозв’язку, а потім зчитування, що належать до кожного зразка, були розділені штрих-кодами, а низькоякісні зчитування видалено . Оброблені теги були згруповані в оперативні таксономічні одиниці (OTU) на загальновживаному порозі подібності 97%. ОТУ були присвоєні таксонам шляхом узгодження з базою даних Greengenes (Випуск 13.8). Було побудовано філогенетичне дерево репрезентативних послідовностей. Були проведені аналізи альфа- та бета-різноманітності. Відстані розраховували за допомогою R (3.3.1, пакет flexmix).

Підвищений плюс лабіринт (EPM) та поведінковий аналіз

Мишей розміщували на лабіринті з чотирма руками плюс дві відкриті руки та дві закриті руки (білий ПВХ, 30 см в довжину на кожну руку × 5 см в ширину), який піднімали на 50 см над землею протягом 15 хв. EPM очищали між мишами 20% розчином етанолу. Кількість входів у розпростерті руки, час, проведений у розпростертих руках, і пройдена відстань у розкритих руках були зафіксовані та проаналізовані програмним забезпеченням Anymaze ® (Stoelting Co., IL, США).

Тест на відкритому грунті (OFT) та поведінковий аналіз

Арену на відкритому полі (50 см × 50 см × 50 см) з білого ПВХ використовували для оцінки як рухової активності, так і поведінки тварин, схожої на тривогу. Записи до Центру, час у Центрі, пройдена відстань у Центрі, загальна відстань, пройдена в OF, середня швидкість в OF протягом 5 хв. Сеансу реєструвались, а потім аналізувались програмним забезпеченням Anymaze ® (Stoelting). Відкрите поле очищали між мишами 20% -ним розчином етанолу.

Статистичний аналіз

Дані були виражені як середнє значення ± SEM (малюнки 1–3) та Box and Whiskers (малюнок 5). Статистичне значення було встановлене стор * стор ** стор **** стор * стор ** стор 0,05, Коена d = 0,43; HFD проти HFD + Met, стор 0,05, Коена d = 0,83; для часу в центрі, штат Нью-Делі проти HFD, стор 0,05, Коена d = 1,36; для відстані в Центрі, штат Нью-Йорк проти HFD, стор 0,05, Коена d = 1,11). В EPM HFD продемонстрував свій ефект у викликанні поведінки, подібної до тривожності, і врятувався спільним лікуванням метформіном. Відстань, пройдена у відкритій руці, зменшилась у HFD порівняно з ND, що полегшилось спільним лікуванням метформіном (Рисунок 3C, n = 5 для кожної групи, кожна точка представляє одну тварину; ND проти HFD, стор 0,05, Коена ds = 0,52 та 0,86; для середньої швидкості, ps > 0,05, Коена ds = 0,53 та 0,87). Хоча не було ніякої кореляції між змінами маси тіла на 21 день та параметрами тестів OFT та EPM (усі R дорівнювали 0,05), тоді як параметри тестів OFT та EPM сильно корелювали (для Відстані у відкритих руках EPM проти Відстані в центрі OFT, R у квадраті = 0,43, стор 0,8). Аналіз бета-різноманітності показав значну різницю між групами після несхожості Брея-Кертіса (рис. 5С), незваженого UniFrac (рис. 5D) та зваженого аналізу UniFrac (рис. 5E, стор Ключові слова: дієта з високим вмістом жиру, метформін, тривога, мікробіота кишечника, ожиріння

Цитування: Ji S, Wang L і Li L (2019) Вплив метформіну на короткочасний приріст ваги з високим вмістом жиру та дієта, схожа на тривогу, та мікробіота кишечника. Спереду. Ендокринол. 10: 704. doi: 10.3389/fendo.2019.00704

Отримано: 10 січня 2019 р .; Прийнято: 30 вересня 2019 р .;
Опубліковано: 18 жовтня 2019 р.

Грем Рена, Університет Данді, Великобританія

Юань Чжоу, Пекінський університет, Китай
Елісон Деламер Макнейлі, Університет Данді, Великобританія