Ентомологія сьогодні

Запропоновано вам Ентомологічним товариством Америки

На цьому кольоровому зображенні медоносної бджоли, зробленому за допомогою низькотемпературного скануючого електронного мікроскопа, видно кліщ Varroa (стрілка), забитий між черевними сегментами бджоли. (Фотографія: USDA-ARS, відділ електронної та конфокальної мікроскопії, Белтсвілль, штат Меріленд)

Гері Баучан, доктор філософії, з Рона Очоа, доктора філософії, Джо Моуері, Кріса Пулі та Денніса ван Енгельсдорпа, доктора філософії.

Varroa destructor, кліщ, який харчується медоносними бджолами, є найбільшим рушієм глобального зниження здоров’я медоносних бджіл. Протягом багатьох років вченим та бджолярам казали, що кліщ Varroa харчується гемолімфою (кров’ю бджіл) на основі давніх наукових досліджень. Однак для нашої дослідницької групи під керівництвом доктора філософії Семюеля Ремсі це не мало сенсу, оскільки травна система та ротовий апарат кліща просто не здавалися належним чином структурованими для годування кров’ю. Їх найближчі еволюційні родичі теж не годували кров’ю. Як зазначив експерт з розведення комах Аллен Коен, доктор філософії, навіть їх екскременти були неправильними, оскільки вони годували кров’ю.

Отже, як і чим саме харчуються ці кліщі? Наше відкриття задокументовано у статті, опублікованій наприкінці січня в «Трудах Національної академії наук».

Ремзі, тоді доктор філософії студент Денніса ван Енгельсдорпа, доктора філософії, в Університеті штату Меріленд, штат Колледж-Парк, розпочав своє запитання з простого питання: чи харчуються кліщі Varroa лише в одному місці? Якщо кліщі можуть харчуватися де-небудь медоносними бджолами (Apis mellifera), як кліщ на людині, то вони, швидше за все, харчуються тканиною, доступною по всьому тілу бджоли (наприклад, гемолімфою). Однак, якщо кліщі харчуються лише в одному місці, можливо, вони харчуються тканиною, специфічною для цього місця. З 104 спостережень виявлено, що кліщі на дорослих бджолах харчуються лише під черевними пластинками свого господаря. В інших місцях виявлених кліщів, наприклад, на грудній клітці, ознак годування не виявлено. Ремсі вважав, що це може бути місцем їх годівлі, але знав, що йому знадобиться допомога, щоб це довести.

Це призвело Рамсі до офісу Рона Очоа, доктора філософії, дослідницького ентомолога з Лабораторії систематичної ентомології та Відділу електронної та конфокальної мікроскопії (ECMU) Служби сільськогосподарських досліджень Міністерства сільського господарства США (USDA-ARS) у Белтсвіллі, Меріленд та провідний фахівець з кліщів USDA-ARS. На додаток до ідеї, що кліщі Varroa харчуються лише гемолімфою личинок та лялечок, що розвиваються, дослідники ставили під сумнів, чи харчуються кліщі взагалі дорослими бджолами. Деякі вже прийшли до висновку, що підживлення відбувається лише на незрілих бджіл, тому що ми ніколи не бачили підживлення ран дорослих бджіл і тому, що ми вже давно називаємо стадію життя кліщів, виявлених у дорослих бджіл, "форетичним", терміном, який позначає не годування стадія, яка використовує інший організм як спосіб транзиту.

Доктор філософії Гері Баучан, директор ECMU, Очоа та Рамсі використовував рідкий азот, щоб миттєво заморозити медоносних бджіл, які мали кліщів у регіоні, який пропонував годувати Рамзі. Точне положення кліщів на медоносних бджолах було зображено за допомогою низькотемпературного скануючого електронного мікроскопа (LT-SEM). Потім заморожені бджоли видаляли з LT-SEM, а кліщів ретельно від'єднували від бджіл. Під час цього процесу Рамзі контролював час впливу Очоа на рідкий азот, щоб уникнути опіків, поки він видаляв кліщів із заморожених бджіл - ручний процес, який потрібно було зробити приблизно через 10 секунд. Потім бджіл повертали в LT-SEM і знімали місце, де знаходився кліщ.

Кліщ настільки щільно притискається до м’якої перетинки між черевними пластинками бджоли, що залишає чітке враження на ногах і пальпах та рані у мембрані у формі рота. Крім того, у цьому місці годівлі амбулакра (подушечки для ніг) від передніх ніг залишалася прилипла до мембрани бджіл, що дозволяє нам швидко зорієнтуватися у розташуванні тіла кліща щодо бджоли. Ми повторили цю процедуру 10 разів, щоб довести, що саме там годували кліщі.

На цьому кольоровому зображенні, зробленому за допомогою низькотемпературного скануючого електронного мікроскопа, видно відбиток кліща Варроа, що залишився на черевній стінці медоносної бджоли. Білі стрілки ідентифікують подушечки ніг кліща, які залишилися прикріпленими після видалення кліща. Чорна стрілка визначає місце живлення кліща. (Фотографія: USDA-ARS, відділ електронної та конфокальної мікроскопії, Белтсвілль, штат Меріленд)

Поздовжній розріз через замерзаючий перелом безпосередньо через бджолу та прикріпленого кліща докладно підтвердив, що відносно короткі ротові частини Варроа (200 мкм) спочивають безпосередньо всередині бджоли, це ділянка, оточена жировою тканиною тіла та гемолімфою, залишаючи нас з висновком, що кліщі харчуються дорослими бджолами. Далі це припустило нам, що кліщі можуть харчуватися щільним поживними речовинами органом, званим жировим тілом, який є аналогом печінки ссавців.

На цьому поздовжньому знімальному зриві, зробленому за допомогою низькотемпературного скануючого електронного мікроскопа, виявляється поперечний переріз кліща Varroa (червоний) між черевними сегментами медоносної бджоли. (Фотографія: USDA-ARS, відділ електронної та конфокальної мікроскопії, Белтсвілль, штат Меріленд)

Щоб визначити, чи споживається жирове тіло, команді довелося придивитися уважніше. Джо Моуері, науковий співробітник ECMU, і Ремзі збирали та готували зразки, прикріплюючи кормового кліща до бджоли цианоакрилатним клеєм перед обробкою. Потім були отримані та вивчені надтонкі зрізи за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа (ТЕМ). Були виявлені чіткі докази того, що кліщі руйнуються і видаляють жирову тканину тіла за допомогою позаротового травлення (і створюючи точку входу для колоній мікробів).

На цьому мікротопковому зображенні з яскравим полем у напівтонкому зрізі видно кліщ Varroa між черевними сегментами медоносної бджоли, а також місцем рани та жировими тілами. (Фотографія: USDA-ARS, відділ електронної та конфокальної мікроскопії, Белтсвілль, штат Меріленд)

Незважаючи на те, що спостереження та електронна мікроскопія дали чіткі докази живлення тіла, дослідження звернулось до Коннора Гульбронсона, доктора філософії, докторанта Інституту науки та освіти Інституту Оук-Рідж, дослідницького відділу квітково-дитячих рослин USDA-ARS (розташований у в межах ECMU), а також його досвід у галузі флуоресценції та конфокальної мікроскопії, щоб визначити, чи жирове тіло є основною тканиною, що споживається. Ремзі створив дієту, що містить два флуоресцентні біозабарвлення, щоб позначити гемолімфу бджоли (жовту) та жирне тіло (червону). Гулбронсон розробив протоколи для відбілювання екзоскелетів кліщів, дозволяючи візуалізувати внутрішні структури.

Потім бджоли з їхніми сяючими нутрощами піддавались голодному Варроа. Гульбронсон і Рамзі зобразили кліщів з яскраво-червоною флуоресцентною системою травлення з дуже мало помітною флуоресценцією в жовтому діапазоні. Щоб переконатись, що біологічні плями фарбують правильні тканини, кожну бджолу розтинали та знімали для порівняння з флуоресценцією всередині кліщів. Ця робота дала найбільш чіткі докази того, що кліщі споживали переважно жирову тканину тіла.

На цьому флуоресцентному мікроскопічному зображенні кліща Varroa жирове тіло, спожите кліщем, позначається червоним флуоресцентним плямою всередині кишки розсіченого кліща. (USDA-ARS, відділ електронної та конфокальної мікроскопії, Белтсвілль, штат Меріленд)

Всі аспекти цього проекту вишикувались, вказуючи на один висновок, але Ремзі хотів бути впевненим, що ця тканина, що явно споживається у дорослих бджіл, є тією самою тканиною, що споживається у розвитку личинок та лялечок. Щоб визначити цей взаємозв'язок, Ремзі розробив нову систему вирощування in vitro, яка імітувала клітини розплоду, в яких розвиваються незрілі медоносні бджоли, та побудувала лялечок-манок, щоб імітувати господаря кліща. Це дозволило Ремзі та лаборантам Джудіт Джоклік та Девіду Ліму взяти на себе нудне завдання годувати кліщів дієтами, складеними з різних тканин, що цікавлять.

Кліщі, яких годували виключно медоносними бджолами, швидко голодували і давали дуже мало яєць, нічим не відрізняючись від контрольної групи, яка взагалі не отримувала їжі. Однак кліщі, що харчуються виключно жирним тілом, виживають значно краще за всі інші методи лікування і дають набагато більше яєць. Ці відкриття забезпечили дослідженню останній рядок доказів, необхідних для того, щоб твердо сказати, що Варроа не є годувальниками крові, а скоріше харчується жиром.

Дослідники, які вивчали поведінку кліща Varroa destructor, розробили систему вирощування in vitro, яка імітувала клітини розплоду медоносних бджіл (Apis mellifera) з лялечками-манками всередині, щоб годувати кліщів гемолімфою та жировою тканиною тіла. (Фото оригінально опубліковано в Ramsey et al 2019, Proceedings of the National Academy of Sciences. Перевидано з дозволу.)

У сукупності цей мультидисциплінарний підхід до аналізів годівлі, спостережного аналізу та різних технологій мікроскопії породив зміну парадигми у нашому розумінні того, як, де і що отримує кліщ Varroa при паразитуванні на медоносних бджіл-господарів. Це дослідження надає шлях розвитку стратегій боротьби з цим головним шкідником медоносних бджіл у всьому світі.

Члени дослідницької групи з питань електронної та конфокальної мікроскопії (ECMU) Varroa при Службі сільськогосподарських досліджень Міністерства сільського господарства США (USDA-ARS). Стоять (зліва направо): Кріс Пулі, ІТ-спеціаліст; Гарі Баучан, директор ЄКМУ; Джо Мауері, фахівець з просвічуючого електронного мікроскопа; та Коннор Гулбронсон, доктор філософії, докторант Інституту науки та освіти Оук-Ридж. Сидять (зліва направо): Рон Очоа, доктор філософії, ентомолог і акаролог, Лабораторія систематичної ентомології USDA-ARS, і доктор філософії Семюел Ремзі, тоді докторант Університету штату Меріленд. (Фотографія: USDA-ARS, відділ електронної та конфокальної мікроскопії, Белтсвілль, штат Меріленд.

Читати далі

Праці Національної академії наук