Високо біодоступна форма берберину покращує опору на глюкокортикоїди, опосередковану резистентністю до інсуліну через зниження асоціації рецептора глюкокортикоїдів з фосфатидилінозитол-3-кіназою

Zhaojie Meng 1,2 *, Yang Yu 1,3 *, Yining Zhang 4, Xuehan Yang 1, Xiaoyan Lv 5, Fengying Guan 1, Grant M. Hatch 6, Ming Zhang 1, Li Chen 1

1. Кафедра фармакології Коледжу основних медичних наук Університету Цзілінь, Чанчунь, Цзілінь, Китай.
2. Відділ біомедичних наук, Медичний факультет, Каліфорнійський університет, Ріверсайд, Каліфорнія, США.
3. Ключова лабораторія медичної клітинної біології, Інститут поступальної медицини, Китайський медичний університет, Шеньян, провінція Ляонін, Китай.
4. Перша лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.
5. Друга лікарня Університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.
6. Кафедра фармакології та терапії, Центр дослідження та лікування атеросклерозу, DREAM Манітобський інститут охорони здоров'я дітей, Університет Манітоби, Вінніпег, Манітоба, Канада.
* Ці автори в рівній мірі беруть участь у цьому дослідженні.

Цитування:
Meng Z, Yu Y, Zhang Y, Yang X, Lv X, Guan F, Hatch GM, Zhang M, Chen L. Високо біодоступний препарат берберину покращує резистентність до інсуліну, опосередковану рецепторами глюкокортикоїдів через зниження асоціації рецептора глюкокортикоїдів з фосфатидилінозитол-3-кіназою. Int J Biol Sci 2020; 16 (14): 2527-2541. doi: 10.7150/ijbs.39508. Доступно з https://www.ijbs.com/v16p2527.htm

Ключові слова: Високо біодоступний склад берберину, тверда дисперсія Хуан-Гуя, інсулінорезистентність, фосфатидилінозитол 3-кіназа, глюкокортикоїдний рецептор

Берберин (BBR) - це природний алкалоїд рослини, виділений з китайської трави Rhizoma coptidis і зазвичай використовується для лікування діареї. Багато досліджень показали, що BBR виявляє гіпоглікемічні властивості та покращує резистентність до інсуліну. Раніше ми показали, що BBR пригнічує печінковий глюконеогенез, зменшуючи експресію PEPCK за допомогою активації 5'-аденозинмонофосфат-активованої протеїнкінази (AMPK) [13]. Крім того, показано, що BBR знижує опосередковану дексаметазоном (DEX) резистентність до інсуліну в клітинах тека в пробірці [14]. Отже, BBR може регулювати сигнальний шлях інсуліну в скелетних м’язах через шлях GC/GR.

Низька біодоступність та невизначений механізм дії BBR обмежують його клінічне застосування як протидіабетичного препарату. Раніше ми показали, що тверда дисперсія Хуан-Гуя (HGSD), потрійна система доставки ліків з BBR, каптратом натрію (SC, підсилювач кишкового всмоктування) та PEG6000, приготовлена за технологією твердої дисперсії, різко збільшила 4-кратне збільшення на місці кишкова перфузія і збільшення в 5 разів в природних умовах біодоступність BBR [15, 16]. Було підтверджено, що берберин є головним активним інгредієнтом HGSD, без явних змін після лікування СК [17]. Лікування HGSD дієти з високим вмістом жиру та діабетичних щурів, індукованих STZ, призвело до помітно поліпшеного гіпоглікемічного ефекту порівняно з лише BBR [15]. У цьому дослідженні ми використали три різні моделі резистентності до інсуліну (дієта з високим вмістом жиру, HFD), яких годували стрептозотоцином (STZ) щурами, резистентними до інсуліну клітинами C2C12 та мишами, обробленими дексаметазоном (DEX), щоб дослідити, чи є резистентність до інсуліну опосередковується асоціацією GR з PI3K та чи послаблює лікування HGSD інсулінорезистентність у цих моделях.

Хімічні реагенти

Експерименти на тваринах

Самців щурів Wistar (200-220 г) та мишей ICR (18-22 г) було отримано з Експериментального приміщення для утримання тварин Університету Цзілінь (номер сертифіката: scxk2013-0003). Усі тварини були розміщені в стандартних поліпропіленових клітинах (по три щури або миші в клітці) і утримувались в екологічно контрольованому приміщенні для розведення (температура: 20 ± 2 ° С, вологість: 60 ± 5%, 12 год світло/темний цикл). Тварин акліматизували щонайменше 5 днів, а потім обробляли для різних експериментів.

Приготування твердої дисперсії Хуан-Гуя

HGSD готували з BBR (активний інгредієнт), SC та PEG6000, дотримуючись вагового співвідношення 1: 1: 6 випаровуванням розчинника, як описано раніше [15].

В природних умовах тваринні моделі та введення ліків

Модель інсулінорезистентності миші була встановлена шляхом ін'єкції DEX (i.p.) у дозі 2 мг/кг протягом 7 днів поспіль, як описано раніше [19, 20]. Мишам контрольної групи вводили (внутрішньовенно) сольовий розчин у рівному обсязі 5 мл/кг. Мишей розділили на 4 групи та обробляли відповідними препаратами за допомогою внутрішньошлункового (ig) введення: (1) контрольна група (контрольні миші, які отримували фізіологічний розчин), (2) модельна група (миші моделі інсулінорезистентності, які отримували відповідний обсяг сольового розчину ), (3) група лікування BBR (інсулінорезистентні миші з модельної групи, яка отримувала 150 мг/кг BBR), (4) група лікування HGSD (інсулінорезистентні миші з модельної групи, які отримували HGSD в еквівалентній дозі 150 мг/кг BBR ). Потім мишей жертвували через 7 днів.

Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози (IPGTT) або пероральний тест на толерантність до глюкози (OGTT) проводили в кінці прийому препарату в обох в природних умовах моделі. Через 12 год голодування вводили глюкозу (2 г/кг) (внутрішньовенно у щурів та внутрішньовенно у мишей). Кров відбирали з каудальної вени через 0, 30, 60, 90 та 120 хв після введення глюкози, а концентрацію глюкози у зразках сироватки визначали за допомогою набору глюкозооксидаз.

Тканину збирали у тварин після голодування протягом 12 год в кінці кожного дослідження. Щурів знеболювали 20% уретаном (100 мг/кг), а з черевної аорти брали зразки крові. Зразки крові у мишей відбирали з вени очного дна. Зразкам крові давали згорнутися протягом 30 хв при 4 ° C і центрифугували (3500 × g, 10 хв, 4 ° C). Супернатант використовували для вимірювання глюкози та інсуліну. Глюкозу в крові вимірювали за допомогою набору глюкозооксидаз. Інсулін вимірювали радіоімуноаналізом. Потім скелетний м’яз тварин збирали після перфузії та жертви для оцінки білка. Рівні специфічного білка визначали за допомогою Вестерн-блот-аналізу.

Приготування HGSD кондиціонованої сироватки

Кондиціоновану сироватку HGSD готували, як описано раніше [21]. Коротко кажучи, 18 щурів випадковим чином розділили на три групи і вводили з датчиками HGSD, окремим носієм або фізрозчином. Щурів годували або 3 мл фізіологічного розчину двічі на день протягом 3 днів, або HGSD двічі на день протягом 3 днів з еквівалентною дозою 1000 мг/кг BBR, яку оцінювали як 10-кратну дозу, дану діабетичним щурам з нашого попереднього дослідження [22]. . Через 30 хв після введення на третю добу кров отримували з аорти щурів у стерильних умовах і давали їй згортатися при 25 ° С протягом 4 год. Сироватку відокремлювали центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 20 хв. Після фільтрування через 0,45 мкм целюлозну ацетатну мембрану двічі сироватку інкубували на водяній бані при 56 ° C протягом 30 хв, а потім зберігали при -80 ° C до використання. Концентрація BBR у сироватці, що визначається HGSD, виявлена за допомогою ВЕРХ, становила 28,46 ± 3,77 мкМ.

Культура клітин C2C12, диференціація та ідентифікація

Клітини міобластів C2C12 підтримували у субконфлюентних умовах у середовищах для росту, що містять DMEM з 4,5 г/л глюкози, 100 од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 10% фетальної бичачої сироватки (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA). Всі клітини вирощували у зволоженому 37 ° С інкубаторі з киснем навколишнього середовища та 5% СО2.

80% злиття диференціювали за допомогою інкубації з 2% кінської сироватки (HyClone, Логан-Сіті, штат Юта, США). Клітини витримували протягом 3-7 днів для отримання міотрубок. Через 5 днів міотрубки інкубували з антитілами (1: 200) до важкої ланцюга міозину (MF20, Санта-Крус, США) та ядрами, забарвленими Hoechst 33342 (1 мкг/мл). Зображення отримували за допомогою імунофлуоресцентного мікроскопа.

Життєздатність клітин

Життєздатність клітин визначали методом МТТ на 96-лункових планшетах для культури тканин, як описано раніше [23]. Після обробки живильне середовище видаляли із лунок і до кожної лунки додавали 200 мкл реагенту МТТ (Sigma) у концентрації 1 мг/мл у PBS. Після 4 год інкубації при 37 ° С реагент МТТ у PBS видаляли, а продукт блакитного кольору формазану розчиняли в 0,15 мл ДМСО протягом 20 хв. Поглинання перетвореного барвника вимірювали при довжині хвилі 570 нм за допомогою спектрофотометра.

Модель резистентності до інсуліну клітин C2C12 та медикаментозне лікування

Після диференціації протягом 2 днів клітини C2Cl2 інкубували у відсутності або в присутності 100 нМ інсуліну протягом 72 год, щоб викликати інсулінорезистентність. Потім клітини випадковим чином розділили на групи: (1) контрольні неінсулінорезистентні клітини, оброблені +/- інсуліном, (2) інсулінорезистентні клітини, оброблені +/- інсуліном, (3) інсулінорезистентні клітини, оброблені +/- інсуліном та оброблені з 5 мкМ BBR, (4) інсулінорезистентних клітин, оброблених +/- інсуліном і оброблених 5 мкМ HGSD кондиційованою сироваткою, (5) інсулінорезистентних клітин, оброблених +/- інсуліном та оброблених контрольною сироваткою, (6) інсулін- стійкі клітини, оброблені +/- інсуліном та оброблені порожньою сироваткою. У деяких експериментах інсулінорезистентні клітини, оброблені +/- інсуліном, обробляли 1 мкМ RU486. Всі препарати додавали за 12 год до закінчення експерименту.

Споживання глюкози та засвоєння глюкози

Споживання глюкози вимірювали, як описано раніше [24, 25]. Вищевказані клітини інкубували у безсироватці з низьким вмістом глюкози (5,5 мМ) DMEM протягом ночі. Потім клітини обробляли інсуліном (100 нМ) та препаратами у свіжому безсироватковому сироватці з низьким вмістом глюкози (5,5 мМ) DMEM. Після 12 годин інкубації середовище видаляли і вимірювали концентрацію глюкози в середовищі за допомогою набору глюкозооксидаз. У деяких експериментах клітини кожної групи інкубували з інсуліном (100 нМ) за 30 хв до закінчення експерименту.

Після диференціації вищезазначені клітини промивали 3 рази KRB, що містить 0,5% BSA, з інтервалом у 40 хв протягом 2 год при 37 ° C, а потім попередньо інкубували з ліками та інсуліном (100 нМ) протягом 3 годин. Згодом клітини інкубували в 200 мкМ 2-NBD-глюкози в PBS протягом додаткових 30 хв, а потім промивали 3 рази крижаним PBS. Інтенсивність флуоресценції клітин визначали за допомогою флуоресцентної мікропланшету. У деяких експериментах клітини кожної групи інкубували з інсуліном (100 нМ) протягом 10 хв.

Транслокація GLUT4

Поверхневу щільність клітин GLUT4 вимірювали у фіксованих та непроникних міотрубках C2C12, використовуючи аналіз поглинання, пов'язаний з антитілами, як описано раніше [26]. Коротко кажучи, після обробки, як описано вище, клітини виснажувались у сироватці крові протягом 2 год, а потім інкубували плюс-мінус інсуліну (100 нМ) протягом 10 хв. Потім клітини двічі промивали крижаним PBS, фіксували 3% (об/об) параформальдегідом при 4 ° C протягом 10 хв, а потім інкубували при кімнатній температурі протягом додаткових 20 хв. Всі наступні етапи проводили при кімнатній температурі. Потім клітини інкубували з 0,1 М гліцином у PBS протягом 10 хв, а потім блокували 5% знежиреного молока (мас./Об.) У PBS протягом 10 хв. Інкубація з поліклональними антитілами проти GLUT4myc (1: 250) у 5% молоці в PBS протягом 1 години супроводжувалася п’ятьма промиваннями з PBS та інкубацією з кон’югованим HRP козячим анти-кролячим IgG (1: 2000) протягом 1 години. Клітини широко промивали PBS та інкубували з 1 мл/лункою 0,4 мг/мл реагенту о-фенілендіаміну дигідрохлориду протягом 20 хв. Реакцію зупиняли додаванням 0,25 мл 3 N HCL. Супернатант збирали, і оптичне поглинання вимірювали при 492 нм. Фонове поглинання, отримане з лунок міотрубок дикого типу C2C12, віднімали з усіх інших значень.

Вестерн-блот-аналіз

Тканину скелетних м’язів (50 мг) та клітини C2C12 гомогенізували при 4 ° C в 1 мл або 500 мкл відповідно крижаного буфера TES (20 мМ Tris-HCl, рН 7,4, що містить 250 мМ сахарози, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду, 0,01 мМ лейпептину та 5 мкг/мл апротиніну). Лізат центрифугували при 10000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° С. Аликвоти надосадової рідини видаляли для аналізу білка методом Бредфорда (Bio-Rad). Зразки денатурували кип'ятінням протягом 5 хв, розділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі 10% SDS, а потім електроблотували на мембрани полівінілідендифториду (Bio-Rad) при 4 ° C. Після блокування 5% (мас./Об.) Знежиреного молока протягом 2 год. При кімнатній температурі мембрани потім інкубували з відповідними первинними антитілами з легким перемішуванням протягом ночі при 4 ºС. Мембрани промивали 3 рази протягом 10 хв кожною по 15 мл TBST (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl і 0,1% (об/об) Твін-20), а потім інкубували з вторинними антитілами (кон'югована пероксидаза хрону 1: 2000) козячого анти-кролячого або мишачого IgG) при кімнатній температурі протягом 2 год. Білкові смуги візуалізували за допомогою ECL на рентгенівській плівці, а потім сканували та кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Quantity One (Bio-Rad).

Вимірювання кортикостерону, характерного для скелетних м’язів

50 мг скелетної м’язової тканини гомогенізували, а потім обробляли ультразвуком у 500 мкл холодного PBS. Після центрифугування при 5000 × g протягом 10 хв аліквоту надосадової рідини видаляли для визначення рівнів кортикостерону за допомогою набору імуноферментного аналізу кортикостерону (№ за каталогом KGE009, R&D System) відповідно до інструкцій виробника.

Експерименти з ко-імунопреципітацією

50 мг скелетної м'язової тканини гомогенізували протягом 5 хв у холодному 1% -ному нонідеті-P40. Суміш витримували на льоду протягом 60 хв перед центрифугуванням при 10000 × g протягом 10 хв при 4 ºC. Супернатант (аліквоти 2 мг білка) інкубували з 4 мкг антитіла до PI3K протягом ночі при 4 ° C. Потім додавали білки агарози A/G (25 мкл) (Santa Cruz Biotechnology Inc.) та інкубували протягом 2 годин при 4 ° C. Імунопреципітати промивали 3 рази буфером А, а потім гомогенізували при 4 ° С у крижаному буфері TES, а рівні pIRS1 (1: 1000), GR (1: 1000) та GRα (1: 1000) визначали методом Вестерн-блот аналіз, як зазначено вище.

Статистичний аналіз

Дані (n > 6) виражаються як середнє значення ± стандартна помилка (SE). Дані (n ≤ 6) виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). Статистичну значимість визначали за допомогою двостороннього t-тесту Стьюдента або одностороннього або двостороннього ANOVA з подальшим тестом Tukey post hoc. стор Tyr632, Total-IRS1, pAKT Ser473, Total-AKT, мембрана GLUT4 та GAPDH у контрольних та діабетичних щурів та діабетичних щурів, які отримували BBR (BBR 100 мг/кг) або HGSD (25 мг/кг) або HGSD (100 мг/кг) ). Відносні рівні мембрани GLUT4 (B), pIRS1/IRS1 (C.), pAKT/AKT (D) і кортикостерон скелетних м’язів (Е). n = 3-6. Дані представлені як середнє значення ± SD двох або трьох незалежних результатів. * стор

Отримано 2019-8-20
Прийнято 2020-7-3
Опубліковано 2020-7-19