Вірус папіломи людини та захворювання коронарних артерій у клімактеричних жінок: чи існує асоціація?

1 Біобанк пухлин і ДНК з Мараньяна, Федеральний університет Мараньяо, Сан-Луїс, Бразилія

2 Група молекулярної онкології та вірусної патології, Португальський інститут онкології, Порту, Португалія

3 Федеральний університет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилія

Анотація

1. Вступ

Серцево-судинні захворювання є основною причиною смерті та є основною проблемою охорони здоров'я у всьому світі. У всьому світі на них припадають мільйони смертей, а в Бразилії вони становлять 29,4% усіх смертей [1, 2]. Дійсно, ішемічна хвороба серця (ІХС) характеризується недостатнім кровопостачанням серця через коронарні артерії, що призводить до інфаркту міокарда [3, 4]. Важливі фактори ризику розвитку ІХС добре відомі, включаючи гіпертонію, діабет, дисліпідемію та куріння [2, 3, 5]. Однак у кількох осіб з ІХС не виявляється жодного з цих факторів ризику, що стимулює розслідування інших детермінант або пов'язаних з ними змінних [4, 5].

Інфекції кількома агентами, такими як ВІЛ, вірус Епштейна-Барра, цитомегаловірус та Хламідіозна пневмонія були запропоновані як фактори ризику розвитку ІХС, можливо, шляхом сприяння хронічному запальному статусу [6, 7]. У цьому контексті важливу роль може зіграти вірус папіломи людини (ВПЛ), одна з найпоширеніших інфекцій, що передаються статевим шляхом у всьому світі. ВПЛ включає понад 200 підтипів, які етіологічно пов’язані з розвитком доброякісних та злоякісних уражень. ВПЛ 16 та 18 є найпоширенішими типами “високого ризику” і тісно пов’язані з раком шийки матки та іншими злоякісними захворюваннями [8]. У загальній популяції жінок поширеність ВПЛ-інфекції становить 2-44% [8]. У країнах, що розвиваються, поширеність становить 21-48%, при цьому ВПЛ високого ризику виявляється у 48-53% інфікованих осіб [9-11]. Протягом багатьох років наша група спеціалізувалася на пухлинах, пов’язаних з ВПЛ, таких як рак статевого члена [12], анальний [13] та шийки матки [14].

Попередні звіти [15] описували, що жінки з вагінальним ВПЛ виявляють втричі підвищений ризик серцево-судинних захворювань порівняно з ВПЛ-негативними жінками. Зовсім недавно ДНК ВПЛ та білки були виявлені в 50% атероматозних коронарних артерій у невеликій вибірці з 20 померлих донорів [16]. Вважається, що зараження ВПЛ сприяє розвитку ІХС шляхом надання посиленого системного запального стимулу [16], що також спостерігається на трансгенних моделях тварин на ВПЛ [17]. Насправді хронічне невирішене запалення відіграє ключову роль при ІХС [18], і зараження ВПЛ може також сприяти цьому. Поодинокі дослідження стверджують, що ВПЛ може бути виявлений у лейкоцитах циркулюючої крові [19] та ендотеліальних клітинах [20], що може допомогти локалізувати вірус в атероматозних бляшках. Інший напрямок думок вказує на те, що ВПЛ, як і інші віруси, перешкоджає ліпідному обміну, що також може сприяти розвитку ІХС [16, 21]. Отже, дане дослідження було спрямоване на вивчення можливого зв'язку між ВПЛ-інфекцією та ІХС у жінок із клімактеричним станом.

2. Методи

2.1. Етика та вивчення населення

Дослідження поперечного перерізу було затверджено Комітетом з етики Федерального університету Мараньяна (затвердження № 195.357). Письмова інформована згода була отримана від усіх жінок. Розмір вибірки розраховували з урахуванням поширеності 65% жінок із ІХС, позитивними на ВПЛ [15], потужністю 80% та рівнем значущості 5%.

2.2. Критерії включення та виключення

Добровольці з САПР і без нього включалися, якщо їм було старше 35 років та клімактерично. Особи з катетеризацією серця після коронарної ангіопластики були розглянуті для зарахування та направлені до гінекологічної служби Клінічного дослідницького центру/UFMA, де вони пройшли клінічне обстеження для підтвердження відповідності. Критеріями виключення були попередня хіміотерапія/променева терапія малого тазу або наявність позитивного ВІЛ-інфекції у сироватці крові.

2.3. Соціодемографічні змінні

Соціодемографічні змінні (вік, етнічна приналежність, освіта, доходи сім’ї, професійна діяльність, сімейний стан, сексуальна поведінка, вживання алкоголю, куріння та фізична активність) досліджували за допомогою напівструктурованої анкети, спеціально розробленої для цього дослідження.

2.4. Супутні захворювання

Під час клінічного обстеження добровольці повідомляли про наявність або відсутність супутніх захворювань (гіпертонія, діабет, розлади щитовидної залози та захворювання, що передаються статевим шляхом). Далі для кожного учасника визначали артеріальний тиск (АТ) та індекс маси тіла (ІМТ). Щодо АТ, добровольці повинні були мати порожній сечовий міхур і не вживали та не вживали алкоголь, каву чи будь-яку їжу принаймні за 30 хвилин до вимірювання. Систолічний та діастолічний АТ вимірювали згідно з рекомендаціями Бразильського товариства кардіологів, використовуючи стетоскоп та ртутний сфігмоманометр [22]. АТ вважався ненормальним, коли АТ дорівнював або перевищував 130/85 мм рт.ст. ІМТ розраховували як відношення між масою тіла в кілограмах, поділеною на квадрат зросту в метрах, і класифікували відповідно до граничних точок ВООЗ [23]: 30,0 (ожиріння).

2.5. Метаболічний профіль

Зразки венозної крові отримували у добровольців після 12-годинного періоду голодування. Після збору в пробірки з антикоагулянтом та без нього плазму та сироватку відокремлювали центрифугуванням та зберігали у морозильній камері -80 ° C до подальшого аналізу. Зразки використовували для проведення гемограм, профілю глюкози (глюкоза натще, інсулін та глікований гемоглобін), ліпідного профілю (загальний холестерин, тригліцериди, ліпопротеїни високої щільності-ЛПВЩ та ліпопротеїни низької щільності-ЛПНЩ), ниркового профілю (креатиніну та сечовини) та високочутливий С-реактивний білок (hs-CRP).

2.6. Виявлення ВПЛ та генотипування

Матеріал шийки матки збирали та подавали на вкладену полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) для генотипування ВПЛ. Вилучення генетичного матеріалу проводили за допомогою набору QIAamp DNA Mini та Blood Mini (QIAGEN, Валенсія, Каліфорнія) згідно інструкцій виробника. Коротко, 400 μL розчину зразка додавали до 400 μL буфера AL і 20 μL протеїнази. Потім 400μл 100% етанолу додавали в кожну пробірку; зразки центрифугували чотири рази і після короткого періоду інкубації знову центрифугували при 8000 об/хв протягом 5 хвилин для елюювання ДНК, яку зберігали при -20 ° C. Концентрацію ДНК визначали за допомогою спектрофотометра NanoVue (GE). Виявлення ДНК ВПЛ проводив L1 ампліфікація генів за допомогою методики PCR-NESTED та пар праймерів PGMY 09/11 та GP 5 +/6 +. Далі продукт першої реакції з праймерами GP5 +/GP6 + ампліфікували.

Після реакцій ПЛР 5 μL кожного зразка піддавали електрофорезу в 1,5% агарозному гелі для перевірки ампліфікації. Продукти ПЛР очищали і згодом секвенували за допомогою автоматизованого секвенсора MegaBACE 1000 (GE Healthcare, Великобританія). Хроматограми отриманих послідовностей аналізували за допомогою програмного забезпечення Chromas (Technelysium), а послідовності подавали в Інтернет-програмне забезпечення BLASTn для ідентифікації типів ВПЛ. Всього було проаналізовано 36 зразків ДНК-ВПЛ, а типи ВПЛ 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 та 58 визначені такими, що становлять високий онкогенний ризик.

2.7. Статистичний аналіз

Дані представлені як абсолютна та відносна частоти. Для отримання скоригованого співвідношення шансів (OR) та довірчих інтервалів (CI) була використана бінарна модель логістичної регресії. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення EpIInfo 7 (CDC, Атланта). A

Змінні, пов’язані з метаболічним ризиком розвитку ІХС в обох групах, зведені в таблицю 2. Не було статистичної різниці між цими двома групами щодо поширеності цукрового діабету чи метаболічного синдрому та значень hs-CRP, індексу маси тіла, глюкози в крові, і тригліцериди. Однак ВПЛ-позитивна група продемонструвала зниження рівня холестерину ЛПВЩ у крові (стор = 0,008) та підвищений системний артеріальний тиск (стор = 0,002) у порівнянні з ВПЛ-негативною групою.

Що стосується присутності ВПЛ, 44,2% усіх жінок були позитивними на ДНК ВПЛ шийки матки, 69,6% з яких із ІХС та 30,4% без ІХС (табл. 2). Серед ВПЛ-негативних жінок поширеність ІХС становила 37,9%. Різниця в поширеності ІХС між ВПЛ-позитивними та негативними групами була незначною (стор = 0,0467), а ОР для САПР становив 3,74 для ВПЛ-позитивних добровольців порівняно з ВПЛ-негативними жінками.

Шістнадцять жінок (30,8%) мали типи ВПЛ високого ризику (16, 18, 33, 39, 45 та 58). Ці добровольці включали 44,5% жінок з ІХС та 16,0% жінок без ІХС (табл. 3). Після коригування за віком та етнічною приналежністю наявність вагінальної ДНК ВПЛ із високим ризиком статистично асоціювалася з ІХС (АБО = 4,90, стор = 0,0384). Наявність інших типів ВПЛ не було пов'язано з ІХС у цьому дослідженні.

4. Обговорення

ВПЛ-інфекція є причиною множинних доброякісних та злоякісних уражень, але рідко пропонується можлива зв'язок із серцево-судинними захворюваннями і залишається спекулятивною. Тим не менш, деякі дані [15] повідомляють, що вагінальні інфекції ВПЛ збільшують ризик серцево-судинних захворювань. В одному дослідженні [16] було виявлено ВПЛ у 55% атероматозних коронарних артерій у невеликій вибірці донорських донорів, а білок ВПЛ E7 виявлений у клітинах гладких м’язів, плазматичних клітинах та пінистих макрофагах, розташованих у цих бляшках. Ці спостереження піднімають питання щодо можливих механізмів, за допомогою яких ВПЛ може сприяти утворенню атероматозних бляшок.

Переважає думка, що ВПЛ залишається обмеженим ураженням епітелію, але деякі автори повідомляють про виявлення ДНК ВПЛ та білків на ендотеліальних клітинах [20] та лейкоцитах циркулюючої крові [19]. Якщо ці спостереження відображають справжнє поширення вірусу, вони можуть допомогти пояснити наявність ВПЛ в атероматозних ураженнях [16]. З іншого боку, якщо ВПЛ залишається обмеженим ураженням слизової, він може бути залучений у ІХС шляхом сприяння системному запальному статусу [17] та дерегуляції метаболізму господаря, зокрема, ліпідів [21]. У цьому дослідженні ми вирішили вирішити деякі з цих питань у клімактеричних жінок. Менопауза пов’язана з хронічним запаленням та має серйозні наслідки для розвитку ІХС [24, 25] та супутніх розладів ліпідів [26]. Частота ВПЛ у цій групі також вища [27] і може діяти синергетично з деякими з цих факторів, щоб посилити серцево-судинний ризик.

Серед клімактеричних жінок ми спостерігали незначно значущий зв’язок між ВПЛ-інфекцією та ІХС. Важливо, що генотипи ВПЛ високого ризику, пов’язані з раком, були вибірково пов’язані з ІХС, тоді як з генотипами низького ризику не спостерігалось. Це відповідає попереднім дослідженням [16], які виявили два найпоширеніші типи ВПЛ високого ризику - HPV16 та HPV18 в атероматозних бляшках, але не типи низького ризику. Цікаво, що тип ВПЛ, який спостерігався в клітинах ендотелію та лейкоцитах крові в попередніх дослідженнях [19, 20], також був ВПЛ високого ризику16.

Наведені результати підтверджують гіпотезу про те, що зараження ВПЛ пов'язане з ІХС, і що існує специфічна асоціація з типами ВПЛ високого (а не низького) ризику. Якщо ВПЛ досягає коронарних артерій і присутній в атероматозних бляшках, це може сприяти їх розвитку завдяки своїм класичним клітинним мішеням p53 та білку ретинобластоми (pRb). Встановлено, що втрата функції р53 у макрофагах сильно пов'язана із збільшенням атеросклеротичних уражень [28–30]. Крім того, нокаутовані тварини для pRb продемонстрували посилений розвиток атеросклерозу [31].

Наведені результати також показують нижчий рівень ЛПВЩ та вищий системний рівень артеріального тиску у ВПЛ-позитивних порівняно з ВПЛ-негативною групою. Хоча це може представляти зміну, пов’язану з менопаузою, статистичні кореляції з ВПЛ-інфекцією були дуже значущими і вимагають пояснень, які можуть включати втручання ВПЛ на ліпідний обмін [21]. Однак зменшена кількість досліджуваних у нашому дослідженні та обмеження лише на клімактеричних жінок та відсутність подальших даних про серцево-судинну систему не дозволяють робити висновки з цього приводу.

5. Висновки

Загалом, у поточному дослідженні ВПЛ-інфекція була пов’язана з більшою ймовірністю виникнення ІХС серед клімактеричних жінок. Цим необхідні перспективні когортні дослідження для вивчення потенційного причинного ефекту ВПЛ-інфекції на розвиток ІХС, і дослідження біологічних механізмів, що лежать в основі цієї асоціації, є обґрунтованим.

Наявність даних

Дані, що використовуються для підтвердження результатів цього дослідження, доступні у відповідного автора за запитом.

Розкриття інформації

Організації, що фінансують, не відігравали ролі в розробці дослідження; збір, аналіз та інтерпретація даних; або написання та остаточне затвердження рукопису.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють, що у них немає конфлікту інтересів.

Подяка

Це дослідження було підтримано FAPEMA (грант # BIC-02582/14, Бразилія), MCTI/CNPq (грант # 460035/2014-2, Бразилія), CAPES/PROCAD (грант # PROCAD/NF2009, Бразилія), LEPABE/FEDER/COMPETE2020 (грант # POCI-01-0145-FEDER-006939, Португалія) та Fundação para a Ciência ea Tecnologia (грант # SFRH/BPD/85462/2012, Португалія). Автори вдячні доктору E.C. Fraga за підтримку під час секвенування ВПЛ-ДНК.