Ваготомія зменшує очищення інсуліну у мишей із ожирінням, запрограмованих за допомогою низькобілкової дієти в підлітковому віці

1 Університет Кампінасу (UNICAMP), Кампінас, Іспанія, Бразилія

ваготомія

2 Державний університет Західної Парани (UNIOESTE), Каскавель, PR, Бразилія

Анотація

1. Вступ

Вважається, що низьке або високе споживання калорій матерями та батьками пов’язане з порушенням гомеостазу глюкози та інсуліну у їхніх нащадків [1]. Мишей утримували на дієті з низьким вмістом білка на ранніх стадіях і годували на контрольній дієті у дорослому віці, а також демонстрували наздоганяючий ріст, пов'язаний з непереносимістю глюкози [2]. Дійсно, економічні покращення в країнах, що розвиваються, впродовж останніх десятиліть поставили людей у ​​подібні умови. У цих суб'єктів прийом нормальної або висококалорійної дієти у зрілому віці, після періоду обмеження калорій на початку життя, збільшує ризик розвитку метаболічних захворювань [3, 4]. Ці ранні екологічні ситуації відомі як прогностична адаптивна реакція або економна гіпотеза фенотипу, постульована Хейлзом та Баркером у 1992 р. [1].

Ми показали, що у мишей, які харчуються в підлітковому віці дієтою з низьким вмістом білка, а потім дорослою їжею з високим вмістом жиру, розвивається непереносимість глюкози, резистентність до інсуліну та знижена секреція інсуліну порівняно з тими, які харчуються дієтою з високим вмістом жирів протягом усього експериментальний період [5]. Це вказує на те, що метаболічне програмування, спричинене недоїданням у ранньому віці, погіршує гомеостаз інсулін-глюкоза більшою мірою, ніж саме ожиріння. Крім того, недоїдають та ожиріння миші можуть виявляти травми нейронів гіпоталамусу, які контролюють споживання та витрату енергії [6]. Миші, що не переносять глюкозу, піддані дієті з низьким вмістом білка на початку життя та контрольній дієті у зрілому віці, також виявляють підвищену вагусну активність, що свідчить про участь парасимпатичної нервової системи в гомеостазі глюкози [2].

Програмування метаболізму можна пояснити концепцією розвитку здоров’я та захворювань (DOHaD), яка описує за допомогою кількох досліджень, як ранні фактори навколишнього середовища, такі як харчування, можуть викликати фізіологічні зміни у плода, новонародженого, підліткового віку та дорослих, що призводить до програма довгострокових наслідків після пологів [7–9].

Таким чином, ми прагнули дослідити вплив субдіафрагмальної ваготомії на чутливість до інсуліну, секрецію та деградацію у запрограмованих на метаболізм мишей, індукованих дієтою з низьким вмістом білка на ранніх стадіях життя з подальшим вживанням дієти з високим вмістом жирів у зрілому віці.

2. Матеріали та методи

2.1. Тварини

Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до протоколів, затверджених Комітетом з догляду та використання тварин Університету Кампінасу (UNICAMP) (номер затвердження: 3379-1). Самців мишей C57Bl/6 отримували від UNICAMP і підтримували при 22 ± 1 ° C протягом 12 годин циклу світло-темрява. Тридцятиденних мишей годували протягом 4 тижнів нормальною білковою дієтою (14% білка) (група NP) або дієтою з низьким вмістом білка (6% білка) (група LP). Після цього мишей LP розподіляли на три групи: LP, яку утримували з низьким вмістом білка; LP + HF, які почали отримувати дієту з високим вмістом жиру (35% жиру) протягом 8 тижнів; та LP + HFvag, який був підданий ваготомії, а також почав отримувати дієту з високим вмістом жиру протягом 8 тижнів. Дієтичні склади були описані в попередньому дослідженні [10].

2.2. Процедура піддіафрагмальної ваготомії

Через 4 тижні після споживання дієти з низьким вмістом білка мишей LP + HF піддавали піддіафрагмальній вантотомії шлунка (група LP + HFvag) або фіктивній операції (LP + HF). Для цієї процедури 12-годинних голодуючих мишей знеболювали сумішшю кетаміну та ксилазину (0,06 та 0,02 мг/г через внутрішньовенне введення, відповідно; Vetbrands®, Paulínia, SP, BRA). Згодом шлунок та стравохід були екстеріорізовані з очеревинної порожнини, і обидва, тильний та піддіафрагматичний вагусний стовбур, відокремлені від стравоходу та відрізані. Підроблені миші проходили ті самі процедури, але блукаючий нерв залишався цілим. Наприкінці експериментального періоду для підтвердження піддіафрагмальної ваготомії затримку їжі в шлунку від усіх груп мишей оцінювали за співвідношенням між вагою шлунка на масу тіла (БТ), згідно з попереднім дослідженням [11–13].

2.3. Тест на толерантність до внутрішньочеревної глюкози та інсуліну

Для внутрішньочеревного (ip) тесту на толерантність до глюкози (ipGTT) мишей голодували протягом ночі (12 год), а з кінчика хвоста відбирали пробу базальної крові (т = 0 хв). Мишам отримували внутрішньовенне введення 2 г/кг глюкози (Labsynth, Сан-Паулу, Бразилія), розчиненої у сольовому розчині (0,9% NaCl мас./Об.), І додаткові зразки крові реєстрували через 15, 30, 60 та 120 хв. Глюкозу реєстрували за допомогою ручного глюкометра (Accu-Chek Performa II, Roche Diagnostics, Швейцарія). Для тесту на толерантність до ip-інсуліну (ipITT) мишей голодували протягом 2 годин і вводили ip-інсулін (Humulin R, Eli Lilly, штат Індіанаполіс, США) (1 Од/кг). Кров брали безпосередньо перед ін'єкцією інсуліну (т = 0 хв) і в рази 3, 6, 9, 12, 15, 18 і 21 хв через відрізання хвоста за допомогою ручного глюкометра. Рівень зникнення глюкози (КITT) розраховували, як описано раніше [14, 15].

2.4. Очищення інсуліну

Під час ipGTT проби крові відбирали з кінчика хвоста перед навантаженням глюкозою (т = 0) та через 15 та 60 хв після введення глюкози та поміщають у мікропробірки, що містять антикоагулянтний гепарин. Пробірки центрифугували при 1100

, 15 хв, 4 ° C, і плазму збирали і зберігали при -80 ° C. Інсулін та С-пептид вимірювали за допомогою інсуліну для щурів/мишей або С-пептиду 2 ELISA Kit (кат. EZRMI-13K та EZRMCP2-21K, EMD Millipore, США, відповідно), відповідно до інструкцій виробника. Кліренс інсуліну оцінювали за співвідношенням С-пептид: інсулін, як описано раніше [16].

2.5. Ізоляція острівців та GSIS

Острівці були виділені шляхом перетравлення колагенази підшлункової залози, як описано Boschero et al. 1995. Для статичних інкубацій групи з п’яти острівців попередньо інкубували протягом 30 хв при 37 ° C з 500 μL буфера Кребса (KBB) із таким складом: 115 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,56 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 15 мМ HEPES; з добавкою 5,6 мМ глюкози та 3 г бичачого сироваткового альбуміну (BSA) на літр; і збалансований із сумішшю 95% O2-5% CO2 для забезпечення рН 7,4. Після цього це середовище замінювали свіжим буфером, і острівці інкубували протягом 1 години з 1 мл KBB, що містить 5,6, 11,1 або 16,7 мМ глюкози. В кінці інкубаційного періоду супернатанти збирали і підтримували при -20 ° C. Для вмісту інсуліну на острівцях збирали групи з п’яти острівців, переносили їх у пробірки, що містять 1 мл деіонізованої води, та гомогенізували за допомогою сонікатору (Brinkmann Instruments, США). Інсулін вимірювали за допомогою RIA з використанням людського інсуліну, міченого 125 I в якості індикатора, стандартного інсуліну щурів (Crystal Chem Inc., США) та антитіл до інсуліну щурів (пожертвував д-р Леклерк-Мейер, Вільний університет Брюсселя, Бельгія). Метод вугілля декстран застосовувався для відокремлення вільного інсуліну від інсуліну 125 I, зв’язаного з антитілами.

2.6. Вестерн-клякса
2.7. Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM, і відмінності вважалися значними при

. Порівняння проводили за допомогою одностороннього ANOVA з подальшим тестом Тукі. Тести проводились із використанням GraphPad Prism, версія 5.0 для Windows (GraphPad Software Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Розмір вибірки визначали з урахуванням ефекту розміру. Для виключення помилок типу II використовували двосторонню статистику з рівнем значимості 5% та потенцією 0,98. За цих умов рекомендований розмір вибірки буде

; однак, ми вибрали розмір

як захід безпеки.

3. Результати

3.1. Дієти та характеристика вагусної денервації

Перш за все, ми охарактеризували недоїдану модель, яка показала знижену масу тіла та загальний вміст білків у сироватці крові (Додаткова фігура

доступно в Інтернеті за адресою https://doi.org/10.1155/2017/9652978). Потім ми підтвердили ефективність дієти з високим вмістом жиру, оскільки миші, що харчувались цією дієтою, страждали ожирінням із посиленим ожирінням. Ми також підтвердили, що ваготомія зменшила масу тіла та жирові прокладки (додаткова фігура 2) на додаток до покращеної толерантності до глюкози та чутливості до інсуліну у мишей із ожирінням, викликаних лише дієтою з високим вмістом жиру (додаткова фігура 3), що є добре відомим ефектом цієї операції. Дивно, але ваготомія не змінила маси тіла та ожиріння у мишей LP + HFvag (табл. 1). Вага шлунка була вищою у LP + HFvag порівняно з вагою у мишей LP + HF, що підтверджує ефективність ваготомії. Глікемія та інсулінемія натощак були вищими у LP + HF порівняно з такими у мишей LP. Інсулінемія натще, але не глікемія, була зменшена у LP + HFvag порівняно з такою у мишей LP + HF (табл. 1). Однак ми не спостерігали різниці в інсулінемії, що годується, порівняно LP + HF з групою LP + HFvag.

). a, b Істотні відмінності (

3.2. Ваготомія покращила толерантність до глюкози, але не чутливість до інсуліну

Під час ipGTT у мишей LP + HF спостерігалася підвищена глікемія (рис. 1 (а)), що свідчить про порушення толерантності до глюкози порівняно з мишами ЛП, як оцінювали за AUC (рис. 1 (b)). Цікаво, що ваготомія відновила толерантність до глюкози у мишей LP + HFvag до рівнів, які спостерігались у групі LP, як це спостерігалося на графіку AUC (рис. 1 (b)). Під час ipITT (рис. 1 (в)) миші LP + HF виявляли порушення чутливості до інсуліну порівняно з групою LP, як це демонструвало КITT (Малюнок 1 (d)). Хоча ваготомія не змінювала чутливості до інсуліну, миші LP + HFvag мали підвищений інсулінемічний корм (табл. 1), що могло пояснити поліпшення толерантності до глюкози у цих мишей.

”Вказують на значні відмінності між LP і LP + HFvag порівняно з LP + HF; "#" Між LP + HF та LP + HFvag; та “&” між LP + HF та LP + HFvag порівняно з LP. Різні літери над смугами вказують на суттєві відмінності. Одностороння ANOVA з подальшим тестом Тукі.

3.3. Знижена ваготомія GSIS на ізольованих острівцях підшлункової залози

Для пояснення вищої інсулінемії, що спостерігається під час ipGTT мишей LP + HFvag, ми отримали доступ до GSIS на ізольованих острівцях підшлункової залози. При низькій концентрації глюкози (5,6 мМ) секреція інсуліну у всіх групах була однаковою. Однак при високій концентрації глюкози (11,1 та 16,7 мМ) спостерігали підвищену секрецію інсуліну на острівцях від LP + HF порівняно з мишами LP. Секреція інсуліну була меншою на острівцях від мишей LP + HFvag, досягаючи подібних рівнів, що спостерігались для групи LP (рис. 2 (а)). Загальний вміст інсуліну в острівцях у всіх групах суттєво не відрізнявся (рисунок 2 (b)).

). Різні літери над смугами вказують на суттєві відмінності. Одностороння ANOVA з подальшим тестом Тукі.

3.4. Ваготомія зменшення очищення інсуліну

Нижчий GSIS мишей LP + HFvag не виправдовував вищої інсулінемії, виявленої у цих мишей під час ipGTT (рис. 3 (а)). Таким чином, ми також оцінили кліренс інсуліну цих мишей (вимірюючи співвідношення С-пептид: інсулін). Відомо, що підшлункова β клітини косекретують інсулін та С-пептид у співвідношенні 1: 1; однак період напіввиведення С-пептиду довший, ніж у інсуліну. Таким чином, збільшення співвідношення С-пептид: інсулін свідчить про підвищений кліренс інсуліну, як це спостерігається у LP + HF, порівняно з мишами LP (Рисунок 3 (c)). Цікаво, що кліренс інсуліну був знижений у мишей LP + HFvag зі зниженим співвідношенням C-пептид: інсулін порівняно з групою LP + HF (рис. 3 (c)), що пояснює вищу інсулінемію цих мишей під час ipGTT.

). Різні літери над смугами вказують на суттєві відмінності. Одностороння ANOVA з подальшим тестом Тукі.

3.5. Ваготомія зменшила експресію IDE у печінці мишей LP

IDE є найважливішим білком, який бере участь у кліренсі інсуліну, явище, яке відбувається переважно в печінці. Отже, ми оцінили експресію білка IDE у печінці мишей. Підтверджуючи дані кліренсу інсуліну, миші LP + HF демонстрували вищу експресію IDE порівняно з групою LP (рис. 4). Експресія цього ферменту в печінці мишей LP + HFvag була знижена, повертаючи його значення, подібні до значень, виявлених у мишей LP (Рисунок 4).


). Різні літери над смугами вказують на суттєві відмінності. Одностороння ANOVA з подальшим тестом Тукі.

4. Обговорення

Попередні дослідження продемонстрували, що запрограмовані на обмін речовин миші, які в дитинстві годували дієту з низьким вмістом білка, а потім у дорослому віці контрольну дієту, розвивали непереносимість глюкози, пов’язану з посиленою вагінальною активністю [2]. Тут ми провели ваготомію на мишах, які тримали їжу з низьким вмістом білка, а потім дотримувались дієти з високим вмістом жиру, щоб перевірити можливу роль парасимпатичної нервової системи в їх гомеостазі інсулін-глюкоза. Ми спостерігали, що ваготомія покращила толерантність до глюкози у запрограмованих на метаболізм мишей за рахунок зменшення кліренсу інсуліну, що, ймовірно, відбувається через знижену експресію ІДЕ печінки.

Відомо, що ожиріння, спричинене дієтою, у мишей також провокує непереносимість глюкози, що супроводжується підвищеною секрецією інсуліну, що компенсує периферичну резистентність до інсуліну [17]. Це явище було також виявлене у запрограмованих на метаболізм мишей, яких у ранньому віці годували дієтою з низьким вмістом білка, а потім дотримувались звичайної дієти [2] або дієти з високим вмістом жиру [5, 18] у зрілому віці. Тут ми підтвердили ці результати за допомогою LP + HF, що показує порушення чутливості до інсуліну та толерантності до глюкози, а також підвищену секрецію інсуліну.

Підвищення вагусної активності у мишей із ожирінням та із запрограмованими на метаболізм метаболізмом було пов’язано із збільшенням ваги та вищою секрецією інсуліну під час годування [2, 19]. Крім того, ваготомізовані ожирілі гризуни продемонстрували знижену масу тіла через зменшення жирових прокладки, пов’язану з поліпшенням толерантності до глюкози, чутливості до інсуліну та секреції. Насправді ми підтвердили, що ваготомія була ефективною, щоб викликати всі ці переваги, у мишей, що страждають ожирінням, викликаних дієтою (рис. S3). Однак маса тіла та жирові прокладки, а також дія та секреція інсуліну були подібними між мишами LP + HF та LP + HFvag. Ці результати свідчать про те, що покращення, яке спостерігалося при гомеостазі глюкози у мишей LP + HFvag, не залежало від змін у складі тіла. Ці результати підтвердили, що ожиріння, спричинене програмуванням метаболізму, є більш проблематичним, ніж ожиріння саме по собі, оскільки запрограмовані миші не виявляли загальновідомих переваг від ваготомії, таких як зниження ожиріння та маси тіла [13, 20–22]. Той самий сценарій спостерігався, коли миші, запрограмовані метаболізмом, отримували добавки таурину, намагаючись поліпшити свій гомеостаз глюкозо-інсуліновий вірус [18].

На противагу нашим висновкам, попередні звіти продемонстрували, що ваготомія не змінювала кліренс інсуліну у худого свині [23]. Це свідчить про те, що індуковане ваготомією зниження кліренсу інсуліну є явищем, яке спостерігається лише у моделі ожирілих мишей, можливо, тому, що вони відчували недоїдання протягом раннього життя. Насправді, у непрограмованих ожирілих щурів ваготомія також зменшувала секрецію інсуліну, але на відміну від наших даних інсулінемія була зменшена [24], що підкріплює нашу ідею про те, що зниження кліренсу інсуліну, викликане ваготомією, може залежати від метаболічного програмування. Хоча це не оцінюється, здається, що у мишей, які рано харчувались дієтою з низьким вмістом білка, а потім дорослим регулярною дієтою, також знижується кліренс інсуліну. Це припущення базується на спостереженні, що вони демонструють збільшену концентрацію інсуліну в плазмі без збільшення секреції інсуліну, стимульованого глюкозою [2]. Однак механізм, за допомогою якого ваготомія зменшує кліренс інсуліну та експресію ІДЕ печінки, залишається незрозумілим.

Хоча знижений кліренс інсуліну та експресія ІДЕ в печінці були пов’язані з інсулінорезистентністю та розвитком непереносимості глюкози [25, 26], у ранньому віці миші IDE KO демонстрували більш високу концентрацію інсуліну в плазмі та покращену толерантність до глюкози. Однак підтримка високих концентрацій інсуліну в плазмі протягом тривалого періоду призвела до інсулінорезистентності та непереносимості глюкози у цих мишей у віці 6 місяців [27]. Здається, це явище спричинене негативним зворотним зв'язком інсулінового шляху, організованим надмірною стимуляцією проксимального каскаду інсуліну. Таким чином, покращення толерантності до глюкози, яке спостерігається у мишей LP + HFvag, може бути тимчасовим ефектом, і ці миші сприйнятливі до розвитку непереносимості глюкози і, отже, T2D.

На закінчення піддіафрагмальна ваготомія покращує толерантність до глюкози у запрограмованих на метаболізм мишей, котрі харчуються дієтою з низьким вмістом білка на ранніх стадіях життя з подальшим вживанням дієти з високим вмістом жиру в зрілому віці. Ваготомія збільшує концентрацію інсуліну в плазмі крові за рахунок зменшення кліренсу інсуліну - явища, ймовірно, через зменшення експресії ІДЕ в печінці. Однак необхідно мати на увазі, що стратегії щодо гальмування вагусної активності для контролю метаболічних захворювань можуть з часом поставити під загрозу толерантність до глюкози.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють, що щодо публікації цієї статті не існує конфлікту інтересів.

Внески авторів

Керував цією роботою Еверардо Магальяйнс Карнейро.

Фінансування

Цю роботу підтримали Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Процес No 2013/27847-6, 2013/07607-8 та 2014/01717-9) та Національний Конселью Пескіза (CNPq).

Подяка

Автори дякують Маріз Брунеллі, Джулії Агулхарі та Джейніфер Соуза за технічну допомогу та Бріджетт А. Боллін за редагування англійською мовою.

Додаткові матеріали