Токсичність та вплив поколінь бісфенолу S на вплив Caenorhabditis elegans на розвиток, біохімічний, репродуктивний та окислювальний стрес †

Сян Сяо

школа харчової та біологічної інженерії, Університет Цзянсу, Чженцзян 212013, КНР. Електронна адреса: nc.ude.sju@2102hxz; Факс: + 86-511-88797201; Тел .: + 86-511-88797202

Сяовей Чжан

Caiqin Zhang

Jie Li

Яншен Чжао

школа харчової та біологічної інженерії, Університет Цзянсу, Чженцзян 212013, Китай. Електронна адреса: nc.ude.sju@2102hxz; Факс: + 86-511-88797201; Тел .: + 86-511-88797202

Ін Чжу

Цзяян Чжан

Синхуа Чжоу

Пов’язані дані

Анотація

Бісфенол А (BPA) - типовий ендокринний руйнівник. Бісфенол S (BPS) широко використовується як замінник різних пластикових матеріалів через обмежене застосування BPA. Однак це не означає, що BPS є безпечним замінником через відсутність ефективної оцінки BPS. У цьому дослідженні клінічну модель Caenorhabditis elegans (C. elegans) використовували для вивчення впливу BPS на поведінку руху, ріст, розмноження, тривалість життя та антиоксидантну систему. Наше дослідження показало, що C. elegans, що зазнали дії 0,01 мкМ BPS, міг суттєво пригнічувати поведінку та ріст руху, а також пошкоджувати репродуктивну та антиоксидантну системи та тривалість життя. Цікаво відзначити, що під час досліджень експозиції, що проводиться в декількох поколіннях, ми виявили, що BPS виявляє складну генотоксичність. З передачею нащадкам BPS продемонстрував більш значне пригнічення головних молотниць нематоди, тоді як вплив на вигини тіла та довжину тіла поступово послаблювався. Вплив BPS на розмір розплоду показує різні правила залежно від концентрації та потомства. Таким чином, безпека BPS все ще потребує подальшої оцінки, особливо генотоксичності для багатьох поколінь.

1. Вступ

Бісфенол A (BPA), ендокринно-руйнуюча хімічна речовина, широко застосовується у синтезі полікарбонатів та епоксидної смоли. 1–3 BPA, як підозрюють, впливає на різні фізіологічні функції та пов’язаний із багатьма захворюваннями людини, такими як діабет, ожиріння, репродуктивні розлади, серцево-судинні захворювання, вроджені вади та рак молочної залози. 4–6 Оскільки все більше доказів свідчать про негативний вплив BPA на здоров’я людини, його спонукали вилучити зі споживчих товарів.7 Ще у 2009 р. Канада першою заборонила використання BPA в продуктах для пляшечок для немовлят та дітей. США (2010 р.), Європейський Союз (2011 р.) Та Китай (2011 р.) Наслідували їхній приклад. Франція навіть почала забороняти використання бісфенолу А у харчових пакувальних матеріалах у 2015 році. 8–10

Дослідження показали, що BPS має властивості естрогену, антиандрогену та тиреоїдних гормонів, що може негативно впливати на репродуктивну систему, ендокринну систему та нервову систему C. elegans та людини, а також може спричинити окислювальний стрес.7 Ullah et al. показали, що BPS спричиняє значне збільшення активних форм кисню та перекисного окислення ліпідів у яєчках щурів, тоді як активність антиоксидантних ферментів та вміст білка значно знижуються.26 Аналогічним чином, концентрація тестостерону в плазмі та яєчках також знижується. Разом із модифікацією активності антиоксидантної системи та індукцією фрагментації ДНК in vitro BPS призвів до зменшення щоденної продукції сперми та значного пошкодження ДНК in vivo. 27,28 Недавні дослідження показали, що BPS може спричинити токсичність для розвитку, гормональний дисбаланс та репродуктивну недостатність. у дорослих даніо. 29,30 Експозиція B1 ембріонів F1 призвела до гіршої виводимості та збільшення рівня вад розвитку у порівнянні з тими, хто не зазнавав BPS.31 BPS може змінити нормальний час розвитку критичного нейроендокринного центру, наслідки якого можуть призвести до раннього синаптогенез та неправильна тонка настройка мозку пізніше в процесі розвитку

Зі збільшенням використання БПС люди постійно потрапляли в навколишнє середовище з БПС, що виявляється невигідним. Існує багато вказівок на те, що БПС став "заміною, до якої викликає жаль". Порівняно з BPA, BPS має вищу термостабільність, сильнішу проникність шкіри та кращу абсорбцію, і може спричинити сильніше навантаження на організм людини. 22,33–35 В даний час токсикологія BPS до кінця не вивчена до кінця, тому безпеці BPS приділяється все більше уваги, особливо ефекту низької токсичності BPS. У цьому дослідженні BPS було піддано дії C. elegans для вивчення його впливу на поведінку рухомого руху, ріст, розмноження, тривалість життя та окислювальний стрес. Генотоксичні ефекти BPS вивчали шляхом впливу декількох поколінь. Порівняно з іншими модельними організмами, C. elegans має переваги невеликих розмірів, сильної репродуктивної здатності, простого вирощування та низької вартості. 36C. elegans - один із класичних модельних організмів у токсикологічній оцінці, чутливий до екзогенних сполук. Метою поточного дослідження є більш комплексна оцінка токсичності BPS.

2. Матеріали та методи

2.1. Реактиви та штами

BPS (чистота ≥ 98%) був придбаний у Sigma-Aldrich. BPS розчиняли в абсолютному етанолі і отримували різні вихідні розчини BPS. Оригінальні розчини BPS розбавляли до 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 та 100 мкМ буфером M9 перед експозицією. Усі абсолютні концентрації етанолу становили 0,1% у кінцевих розчинах БФС. Контролем служили C. elegans, які зазнавали впливу 0,1% абсолютного етанолу в буфері M9, який був відомий як нетоксична доза абсолютного етанолу.

Нематоди, що використовувались у цьому дослідженні, були дикого типу N2, спочатку отримані від Генетичного центру Каеноргабдиту (CGC). Нематоди витримували на пластинах середовища для росту нематод (NGM), засіяних Escherichia coli OP50 при 20 ° C, як описано в посиланні. 37. Яскраві нематоди лізували відбілюючою сумішшю (1 М NaOH, 10% NaHOCl), щоб отримати синхронізовану за віком популяцію личинок L1. C. elegans піддавали дії BPS з L4-личинок протягом 24 годин. Під час тривалості впливу розчини BPS були стабільними. Хоча ми не можемо гарантувати адекватне засвоєння BPS нематодами, попереднє дослідження продемонструвало, що такий спосіб впливу лікарського засобу був ефективним у нематод.34 Нематоди використовувались для оцінки токсичності із летальністю, поведінкою в русі, ростом, розмноженням, тривалістю життя, загальним супероксидом дисмутаза (СОД) та кишкові реактивні форми кисню (АФК) як кінцеві точки.

2.2. Летальність

Відповідно до експериментальної конструкції, BPS розчиняли в абсолютному етанолі для приготування вихідного розчину в концентраціях 0,25, 0,5, 1, 1,5 і 2 M, а потім розбавляли рідким середовищем S для отримання кінцевих концентрацій BPS 0,25, 0,5, 1, 1,5 і 2 мМ; кінцева концентрація етанолу в розчині BPS становила 0,1%. S рідке середовище з 0,1% абсолютним етанолом служило контролем. Оскільки високу концентрацію розчину BPS було важко розвести, приготування розчину BPS з високою концентрацією допомагало ультразвуковим та водяним нагріванням ванни. У кожну лунку 96-лункових планшетів додавали аликвоту 200 мкл досліджуваного розчину для BPS, куди згодом завантажували 30 нематод для кожної концентрації. C. elegans піддавали впливу L4-личинок до 1-го дня, а неактивних оцінювали під розсікаючим мікроскопом. Нематоди вважали мертвими, якщо вони не реагували на подразник за допомогою невеликого металевого дроту.38 Летальність нематод оцінювали за відсотком виживання C. elegans. За кожен експеримент досліджували три повтори.

2.3. Поведінка руху

Поведінка рухомого руху оцінювалась як збиванням голови, так і згином тіла. Для аналізу обмолоту голови досліджувані нематоди піддавались дії ВФС від личинок L4 до 1-го дня. Розбір голови, визначений як зміна напрямку вигину в середині тіла, підраховували протягом 1 хв. Вигин тіла зараховували як зміну напрямку напрямку частини нематод, що відповідає задній цибулині глотки вздовж осі y, припускаючи, що нематода рухається вздовж осі x, і рахували протягом 20 с.39– 41 За експеримент досліджували двадцять нематод.

2.4. Аналізи зміни росту

Зростання нематод оцінювали за довжиною тіла. C. elegans піддавали дії BPS від личинок L4 до 1-го дня. Фотографії нематод були зроблені в перший день дорослості, а довжина тіла кожної окремої нематоди була проаналізована за допомогою програмного забезпечення Image J.40 Тест проводився в мінімум 3 рази.

2.5. Аналізи розмноження

C. elegans піддавали впливу BPS від личинок L4 до 1-го дня, а потім щодня переносили на свіжу тарілку до припинення розмноження. Потомство C. elegans підраховували на етапі L3. Тест проводили принаймні 3 рази.42–44

2.6. Аналізи тривалості життя

Аналіз тривалості життя проводили однаково для всіх нематод при 20 ° C. Досліджувані нематоди переносили на нові пластини NGM щодня з 1 по 4 день після гострого впливу BPS на нематоди. Нематоди переносили кожні 2 дні в нові пластини NGM з 5-го дня. Зразки C. elegans, що виживали, підраховували щодня (починаючи з першого дня дорослості), поки всі нематоди не загинули. Зразки C. elegans, які не рухалися при плавному набиванні (платиновим дротом), були зараховані як мертві. Нематоди, що страждають від внутрішнього люка (дефект відкладання яєць), і ті, що відповзли з пластини NGM, не були включені до підрахунку тривалості життя.42,45–47 Дослідження тривалості життя проводили принаймні 3 рази.

2.7. Аналіз внутрішньоклітинних окисних вільних радикалів

Щоб кількісно визначити, чи обстежена обробка BPS активувала окислювальну шкоду, аналізували вироблення АФК. Внутрішньоклітинні АФК вимірювали, використовуючи 2 ′, 7′-дихлорідігідрофлуоресцеїндіацетат (H2DCFDA). Нефлуоресцентний DCF-DA - це проникний для вільних клітин барвник, який легко перетворюється у флуоресцентний 2 ′, 7-дихлорфлуоресцеїн (DCF) завдяки взаємодії з внутрішньоклітинною пероксидом (H2O2). Нематоди, що зазнали впливу BPS від L4-личинки до 1-го дня, переносили в буфер M9, що містить 1 M CM-H2DCFDA, для попередньої інкубації протягом 3 год при 20 ° C. Рівень АФК кожної випробуваної нематоди визначали за допомогою багатофункціонального флуоресцентного зчитувача мікропланшетів. Довжини хвиль збудження та випромінювання були встановлені відповідно до 485 нм та 535 нм. Одиниця рівня АФК визначається як відносна інтенсивність флуоресценції на 50 випробуваних нематод.48 Тест проводили принаймні 3 рази.

2.8. Аналіз внутрішньоклітинної супероксиддисмутази

Для подальшої кількісної оцінки того, чи обстежена обробка BPS активувала окислювальні пошкодження, було визначено виробництво СОД. Система реакцій ксантину та ксантиноксидази утворює супероксид-аніонні радикали (O2 -), які окислюють гідроксиламін, утворюючи нітрит, який під дією проявника кольору стає фіолетово-червоним. СОД може інгібувати супероксид-аніонні радикали та зменшувати утворення нітриту. Досліджені нематоди, які піддавались дії BPS від L4-личинки до 1-го дня, були ультразвуково порушені і реагували з набором. Після закінчення реакції поглинання вимірювали при довжині хвилі 550 нм.49 Тест проводили принаймні 3 рази.

2.9. Статистичний аналіз

Всі дані були виражені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення (SEM). Графіки були сформовані за допомогою GraphPad Primer 7; статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SPSS 19.0. Односторонній дисперсійний аналіз був використаний для порівняння між контрольною та підданими групами. Рівні ймовірності 0,05 та 0,01 вважалися статистично значущими.

3. Результати

3.1. LC50 BPS гострого впливу C. elegans

Для дослідження токсичної дії BPS LC50 тестували шляхом гострого впливу BPS на C. elegans протягом 24 годин. У таблиці 1 наведено виживання після гострого впливу різних концентрацій BPS. Розрахунок проводився за допомогою модуля PROBIT у програмному забезпеченні SPSS. Аналіз даних показав, що Sig = 0,000 -1, і перетворено на 545,59 мг L -1 .

Таблиця 1

Концентрація/мМ	Разом	Виживання
0	30	30
0,25	30	30
0,5	30	26
1	30	22
1.5	30	18
2	30	13

3.2. Вплив BPS на рухальну поведінку C. elegans при гострому впливі

Щоб дослідити вплив BPS на рухому поведінку C. elegans при гострому впливі, ми проаналізували вплив BPS на молоть голови та вигини тіла нематод (рис. 1A та B; вихідні дані, ESI, таблиця S1 †). BPS може суттєво (p Рис. 1C (вихідні дані, ESI, таблиця S2 †) відображає вплив різних концентрацій BPS на довжину тіла C. elegans при гострому впливі. Порівняно з контролем, довжина тіла була значно (p 1D; вихідні дані, ESI, таблиця S2 †). Розмір розплоду був суттєво (p рис. 2 (вихідні дані, ESI, таблиця S2 †). Тривалість життя C. elegans була значно пригнічена у групах впливу від 0,01 мкМ до 100 мкМ. Тривалість контролю становила 24 дні, а тривалість життя зменшилась до 21 доби, коли концентрація BPS становила 0,01 мкМ. Порівняно з контролем, тривалість життя зменшилась на 12,50%. Коли концентрація BPS становила 100 мкМ, найбільше зменшилася тривалість життя нематод, яка зменшилась на 15,27% порівняно з контролем.

Існує складний взаємозв’язок між нормальним ростом і гомеостазом гормонів щитовидної залози, і руйнування гомеостазу гормонів щитовидної залози може вплинути на нормальний ріст і метаболізм хребетних.53,63 Ми виявили, що довжина тіла C. elegans була значно пригнічена, коли концентрація BPS становила ≥0,01 мкМ, що може бути пов’язано з втручанням BPS в гомеостаз гормонів щитовидної залози. Попередні дослідження продемонстрували, що BPA негативно впливав на постембріональний розвиток через порушення сигналізації гормонів щитовидної залози у хребетних.64 Zhang et al. показав, що BPS, подібно до BPA, може також пригнічувати ріст і розвиток C. elegans через втручання в сигнальний шлях передачі сигналів гормонів щитовидної залози.65

5. Висновок

Наскільки нам відомо, наше дослідження першим використовує C. elegans для оцінки безпеки BPS та перше для оцінки генотоксичних ефектів багаторазового впливу BPS. Наше дослідження демонструє, що BPS може мати негативний вплив на поведінку рухомого руху, ріст, розмноження, тривалість життя та антиоксидантну систему C. elegans. Варто зазначити, що в експерименті з безперервним опроміненням з кількома поколіннями BPS все ще може мати негативний вплив на C. elegans. BPS може не бути безпечним замінником BPA, який може мати подібні токсичні ефекти як BPA. Безпека BPS потребує подальшої оцінки, особливо потенційних генотоксичних ефектів.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють, що не існує конфлікту інтересів.