Роман Adipokine Gremlin 1 протидіє дії інсуліну та підвищує рівень діабету 2 типу та НАЖХП/НАСГ

Анотація

Вступ

Ожиріння є основним фактором зростання поширеності інсулінорезистентності/діабету 2 типу (T2D) та пов'язаних з ним ускладнень, включаючи серцево-судинні захворювання, неалкогольну жирову хворобу печінки (NAFLD) та важку форму, неалкогольний стеатогепатит (NASH). Гіпертрофічне ожиріння з розширеними жировими клітинами тісно пов'язане з резистентністю до інсуліну та запаленою та нерегульованою підшкірною жировою клітковиною зі зниженою здатністю накопичувати надлишки жиру і, навпаки, сприяючи накопиченню ектопічного ліпіду в інших тканинах, включаючи печінку та скелетні м'язи (1). Привабливим терапевтичним підходом для лікування гіпертрофічного ожиріння є сприяння побурінню білої жирової тканини для збільшення біогенезу мітохондрій та витрат енергії всього тіла. Однак існує потреба в нових сенсибілізуючих інсулін препаратах для лікування резистентності до інсуліну/T2D незалежно від впливу на ожиріння.

Ми та інші раніше демонстрували, що підвищена жирова тканина та рівень циркуляції BMP4 можуть протидіяти ожирінню, сприяючи побурінню білої жирової тканини (1,2). Однак як жирова тканина, так і сироватковий рівень BMP4 насправді збільшуються при ожирінні як у людини, так і у мишей (3–5), тоді як бежеві/коричневі маркери жирових клітин знижуються при ожирінні.

Важливою причиною цього є те, що ендогенні антагоністи BMP також збільшені. Жирова тканина людини експресує кілька антагоністів, включаючи Gremlin 1, Noggin, Chordin-like 1, Follistatin та BAMBI (3), але ми виявили, що секретований антагоніст BMP2/4 Gremlin 1 є основним ендогенним антагоністом, що інгібує індуковану BMP4 диференціювання клітин-попередників та білі до перетворення адипоцитів у бежевий/коричневий (3). Крім того, Gremlin 1 - секретується білок, помітно підвищений у жировій тканині при гіпертрофічному ожирінні людини, тоді як він фактично знижений у мишей із ожирінням, у яких Ноггін в першу чергу підвищений (3).

Підвищений рівень цих антагоністів у жировій тканині із ожирінням зменшує передачу сигналів BMP4, прихильність клітин-попередників та подальшу індукцію адипогенезу бежево-коричневого кольору (1,3). Відповідно до цього, ми також продемонстрували, що сигналізація BMP4 помітно знижується в жировій тканині при ожирінні, незважаючи на підвищену експресію та секрецію BMP4 (1,3). У сукупності ці спостереження дозволяють припустити, що Gremlin 1 є цікавою мішенню для ожиріння людини і що він також може брати участь у розвитку гіпертрофічного ожиріння та фенотипу ожиріння при ускладненнях резистентності до інсуліну (тобто T2D та NAFLD/NASH), як маркер посиленого позаматкового накопичення жиру. НАЖХП первинно характеризується накопиченням внутрішньопечінкових триацилгліцеринів (ТГ) і присутній у 75–90% пацієнтів із Т2Д (6,7). НАЖХП може перерости у важкий стан НАСГ, що характеризується розвиненим гістологічним ремоделюванням, включаючи фіброз, часточкове запалення, гепатоцелюлярне балонування та ризик раку печінки.

У цьому дослідженні ми вимірювали рівні сироватки Gremlin 1 та мРНК скелетних м’язів, жирової тканини та печінки у когортах без та з діабетом та у пацієнтів із НАЖХП/НАСГ. Ми також оцінили вплив Gremlin 1 на передачу інсуліну та дію в цих трьох основних тканинах-мішенях на інсулін. Наші результати визначають Gremlin 1 як новий біомаркер та потенційну терапевтичну мішень при резистентності до інсуліну та супутніх ускладнень.

Дизайн та методи дослідження

Вивчення популяцій

Всі дослідження проводились відповідно до Гельсінської декларації. Усі суб'єкти дали письмову інформовану згоду перед тим, як брати участь у дослідженнях.

Когортний FDR/Контроль

У цій когорті було вивчено 34 небідних суб'єкта: 17 осіб з принаймні одним відомим родичем першого ступеня (FDR) з T2D та 17 осіб без відомої генетичної схильності до T2D, визначеного як відсутність сімейної історії (контрольні суб'єкти). Групи були підібрані за статтю (10 жінок в обох групах) та ІМТ та мали подібний вік (Таблиця 1). Для розрахунку інсулінорезистентності та рівнів глюкози натще у плазмі крові застосовували індекс інсулінорезистентності (HOMA-IR) за формулою: HOMA-IR = (глюкоза в плазмі натще × інсулін у плазмі натще)/22,5. Місцеві біоптати підшкірної жирової тканини були отримані з нижньої черевної стінки, як повідомлялося раніше (3). Протокол дослідження був затверджений (S655–03) Етичним комітетом Академії Салгренської, Університет Гетеборга.

Інші когорти

Парні зразки підшкірної, сальникової вісцеральної жирової тканини та печінки відбирали під час лапароскопічної операції на животі, як описано раніше (6). Жирову тканину негайно заморозили у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C. Дослідження було схвалено Комітетом з етики Університету Лейпцига (номер затвердження 159–12–21052012; Лейпциг, Німеччина). ІМТ розраховували за вагою (кілограми), поділеною на квадрат зростання (метри).

Когорта ND/D (таблиця 1): у поперечному дослідженні ми досліджували мРНК GREMLIN 1 у парних зразках вісцеральної/сальникової та черевної підшкірної жирової тканини (n = 233; ІМТ> 30 кг/м 2). З них 105 осіб мали нормальний рівень глюкози, а 128 мали T2D.

Когортний GIR (таблиця 1): у 93 осіб (ІМТ 24–37 кг/м 2) з нормальною толерантністю до глюкози (NGT) оцінювали мРНК жирової тканини GREMLIN 1 щодо швидкості інфузії глюкози (GIR) в еуглікемічно-гіперинсулінемічних затискачах. згідно з описаними раніше процедурами (6).

Когорта ND/D/NAFLD (таблиця 1): когорта з 52 осіб із ожирінням з широким діапазоном вмісту жиру в печінці та з (n = 28; ІМТ 34 ± 5,8 кг/м 2) або без T2D (n = 23; ІМТ 34 ± 5,9 кг/м 2). МРНК GREMLIN 1 вимірювали як у парних жирових тканинах, так і в зразках печінки. Для вимірювання метаболічних параметрів усі вихідні зразки крові відбирали між 8 і 10 ранку після нічного голодування та аналізували, як описано раніше (6).

Когорта Nob/obND/obD (Таблиця 1): рівні гремліну 1 у сироватці крові аналізували у 45 осіб з або NGT (n = 30) з ІМТ 2 (n = 15), або> 30 кг/м 2 (n = 15), або з відомим T2D (n = 15).

Двохетапне втручання в баріатричну хірургію являло собою когорту з 55 осіб із патологічним ожирінням, які пройшли двоступеневий баріатричний хірургічний втручання з первинним кроком рукавної гастректомії, а через 12 ± 2 місяці - шунтування шлункового шунтування другий крок, як повідомлялося раніше (8).

Ці різні когорти також були по суті нейтральними до статі, із 70% жінок та 30% чоловіків, і вони зведені як блок-схема на додатковій фіг. 1.

Діагностика діабету

Діагноз T2D проти нормальної або порушеної толерантності до глюкози базувався на результатах тесту на толерантність до перорального прийому глюкози у кількості 75 г згідно з критеріями Американської діабетичної асоціації (9). T2D визначали за 120-хвилинною глюкозою ≥11,1 ммоль/л або повторним глюкозою у плазмі натще ≥7,0 ммоль/л.

Практично всі пацієнти з діабетом отримували метформін, а деякі, за потреби, інгібітором дипептидилпептидази. Тільки ці ліки використовувались для лікування діабету в цих когортах. Пацієнти з підвищеним рівнем холестерину та/або артеріальним тиском отримували регулярні ліки за необхідності.

Діагностика НАЖХП/НАСГ

У когорті людини, для якої були доступні паралельні біопсії печінки та жирової тканини, НАФЛД та НАСГ були визначені та діагностовані гістологічно (з використанням предметних предметів, зафарбованих гематоксиліном та еозином та трихромом Массона) відповідно до попередньої пропозиції щодо класифікації та постановки гістологічних уражень. виявляється при біоптатах печінки (10). Відповідно, два незалежні та спеціалізовані патологоанатоми печінки в Університеті Лейпцига оцінили гістологічні ураження - стеатоз, балонізацію та внутрішньоацинарне та портальне запалення - та підсумували результати в балах (11).

Виявлення Gremlin 1 у сироватці крові людини

Сендвіч-ІФА використовували для вимірювання рівня гремліну 1 у сироватці крові у зразках. Gremlin 1 було захоплено за допомогою розроблених власноруч моноклональних антитіл проти Gremlin 1 (MedImmune, Gaithersburg, MD) на 96-лунковій пластині на половині площі. Зразки інкубували протягом 1-2 годин з подальшим виявленням на кролячих поліклональних антитілах (номер за каталогом ab157576; Abcam) протягом 1 години. Кролик-поліклональ виявляли за допомогою кон’югованих проти кроликів поліклональних антитіл, кон’югованих пероксидазою хрону. Рівні Gremlin 1 у зразках інтерполювали, використовуючи стандартну криву, сформовану в 50% імунодефіцитній сироватці.

Клітинні експерименти

Первинні адипоцити людини

Первинні адипоцити людини були виділені, як описано раніше (12). Коротко кажучи, підшкірні жирові тканини, отримані за допомогою голкової біопсії, перетравлювали колагеназою типу II (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) протягом 60 хв при 37 ° С у струшуючій водяній бані. Потім адипоцити фільтрували через нейлонову сітку 250 мкм і промивали чотири рази з подальшим вимірюванням розміру клітини, екстракцією РНК/білка та/або додатковими експериментальними аналізами. Для передачі сигналів інсуліну та оцінки засвоєння глюкози адипоцити додатково інкубували в середовищі Хенка 199, рН 7,4 (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія), що містить 4% BSA із 6 ммоль/л глюкози або без неї відповідно.

Для поглинання глюкози адипоцити попередньо обробляли IgG або антитілом проти Gremlin 1 (MedImmune) та/або рекомбінантним Gremlin 1 (200 нг/мл) (R&D Systems, Inc., Міннеаполіс, Міннесота) протягом 3 год і стимулювали 10 нмоль/Л інсуліну протягом 15 хв перед додаванням глюкози D- [U-14 C] (0,26 мКі/л; кінцева концентрація 0,86 мкмоль/л) (PerkinElmer, Waltham, MA) протягом 45 хв. Поглинання глюкози негайно припиняли відокремленням адипоцитів від середовища, а включену радіоактивність вимірювали в сцинтиляційному лічильнику.

Первинні клітини скелетних м’язів

Супутникові клітини були виділені від п'яти донорів за допомогою NGT. Клітини вирощували до> 80% злиття в DMEM/F12, що містить 10% FBS та антибіотики, і далі диференціювали в багатоядерні міотрубки в середовищі диференціювання (DMEM, середовище 199, HEPES, сульфат цинку, вітамін B12, FBS та антибіотики), як описано ( 13). Потім клітини голодували протягом 4 год перед інкубацією з рекомбінантним Gremlin 1 (50 нг/мл) та інсуліном (1–10 нмоль/л).

Гепатоцити людини

Первинні гепатоцити людини, HiPS-Hep (Takara Bio Inc., Shiga, Японія), культивували в гепатоцитарному середовищі (Takara Bio) відповідно до інструкцій виробника. Клітини голодували за 3 год до попередньої обробки рекомбінантним Gremlin 1 (50 нг/мл) та інсуліном (100 нмоль/л).

Клітини печінки HepG2 (ATCC, Manassas, VA) та IHH (гепатоцитарний клітин людини) культивували в DMEM (Лонза, Базель, Швейцарія) з додаванням 10% FBS та антибіотиків. Для вивчення секреторних ефектів Gremlin 1 клітини HepG2 трансфікували плазмідами wt.Grem1.myc або trunc.Grem1.myc (експресуючи myc-мітку, злиту з COOH-кінцем Gremlin 1 людини з або без N-кінцевого сигнального пептиду послідовність), побудована в нашій лабораторії. Для конфокальної візуалізації клітини вирощували на предметних предметних стеклах (Thermo Fisher Scientific) протягом 72 годин. Потім клітини промивали PBS, фіксували 4% формальдегідом, проникли 0,1% тритоном, блокували 20% козячої сироватки (1 год) та інкубували з антитілом до антитіла (Sigma-Aldrich) протягом 3 годин. Після промивання PBS та інкубації з дослідженим Alexa 488 вторинним антитілом протягом 1 год клітини монтували за допомогою монтажного розчину Vectashield, що містить DAPI (Vector Laboratories, Inc). Потім конфокальні зображення збирали за допомогою конфокального мікроскопа Leica SP5.

Для вивчення ефекту інгібітора білкової тирозинфосфатази 1B (PTP1B) (CAS 765317–72–4; Merck Millipore, Danvers, MA) ІГХ голодували та попередньо обробляли інгібітором (10 мкмоль/л) з рекомбінантним гремліном 1 або без нього ( 200 нг/мл) протягом 24 год, а потім інсулін (10 нмоль/л) протягом 10 хв.

Кількісна ПЛР у режимі реального часу

ІРНК виділяли з клітин і тканин з подальшим синтезом кДНК. Потім експресію гена аналізували за допомогою системи QuantStudio 6 Flex TaqMan (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Відносне кількісне визначення експресії генів нормалізували до 18S рРНК або HPRT1. Праймери та зонди були або розроблені, або комерційно замовлені як попередньо розроблені набори зондів TaqMan (Assay On-Demand; Applied Biosystems).

Імуноблотинг

Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано раніше (14). Були використані наступні первинні антитіла: Gremlin 1 (MedImmune), pAktS473, AKT (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pY20, IRβ (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) та IRS1 (Merck Millipore).

Аналіз активності PTP1B

Активність PTP1B оцінювали за допомогою набору для аналізу активності PTP (Millipore). Коротко кажучи, ІГХ лізували в буфері для лізису без браку ортованадата натрію. Потім PTP1B іммонопреципітували, використовуючи антитіло PTP1B (Millipore). Вимірювання активності PTP1B проводили за допомогою синтетичного фосфопептиду тирозину (TSTEPQpYQPGENL). Вивільнення фосфату вимірювали при OD 650 нмоль/л за допомогою реагенту малахітового зеленого, що постачається в комплекті.

Статистичний аналіз

Експериментальні дані відображаються як середнє значення ± SD або середнє значення ± SEM. Значимість вказана на рисунках як P 2, вік 34 ± 9 років) та FDR (ІМТ 24,9 ± 2,3 кг/м 2, вік 38 ± 8 років) у суб’єктів з T2D, мРНК GREMLIN 1 була значно вищою в підшкірній жировій тканині цієї підгрупи FDR з високим ризиком порівняно з відповідною контрольною групою (рис. 1А). Крім того, рівні GREMLIN 1 позитивно корелювали із відсотком жиру в організмі та резистентністю до інсуліну, виміряними як HOMA-IR (рис. 1B та C). FDR як група є більш стійкими до інсуліну, ніж група, що не відповідає ІМТ.