Ретинопатія у дієтологічних моделях діабетичних щурів типу 2 та роль епігенетичних модифікацій

Анотація

Вступ

Поширеність діабету у всьому світі зростає швидкими темпами, і серед населення, що страждає на діабет, на діабет 2 типу доводиться 90% всіх випадків у всьому світі. Фізична бездіяльність, споживання трансжирів та ожиріння вважаються головним фактором зростання діабету (1,2). Швидке збільшення захворюваності на діабет також посилює загальний тягар діабетичних ускладнень, включаючи втрату зору через діабетичну ретинопатію (3), а експериментальні моделі є ключем до розуміння молекулярних механізмів терапевтичних втручань.

Діабетичне середовище посилює окислювальний стрес, і вважається, що окислювальний стрес відіграє важливу роль у розвитку діабетичної ретинопатії (12–14). При цукровому діабеті мітохондрії сітківки пошкоджені, а пошкодження ДНК більш масштабні у ділянці петлі витіснення (D-Loop) мтДНК, областях, важливих для транскрипції та реплікації мтДНК. Крім того, експресія багатьох генів сітківки та білків, пов'язаних з гомеостазом мітохондрій, змінена (14,15). Експериментальні моделі задокументували, що збільшення кількості цитозольних реактивних форм кисню (АФК) передує мітохондріальній дисфункції (16), а НАДФН-оксидаза 2 (Nox2) є одним з основних ферментів, пов'язаних з виробленням цитозольної АФК. Rac1, маломолекулярний G-білок, є обов’язковим компонентом голоферменту Nox2, і при діабетичній ретинопатії сигналізація Rac1-Nox2-ROS активується до пошкодження мітохондрій (17).

Недавні дослідження зафіксували, що ферментативний механізм, відповідальний за епігенетичні модифікації, модифікації, які можуть змінювати експресію гена, не впливаючи на послідовність ДНК, також змінюється при цукровому діабеті (14,15,18). Активуються ферменти, що відповідають за підтримання статусу метилювання ДНК, ДНК-метилтрансферази (Dnmts) і десять одинадцять транслокаційних метилцитозин діоксигеназ (Tets), і мтДНК гіперметилюється в сітківці та її судин у гризунів діабету 1 типу та донорів людини із задокументованою діабетичною ретинопатією (19). Однак, як ожиріння/гіперліпідемія впливає на метилювання ДНК та його ферментативні механізми в гіперглікемічному середовищі, незрозуміло.

Гіперглікемічна модель щурів з високим вмістом жиру та стрептозотоцином (Stz) зараз використовується для нервових ускладнень та фармакологічних скринінгів (20, 21), але розвиток діабетичної ретинопатії на цій тваринній моделі не з’ясовано. Нашою метою було дослідити розвиток діабетичної ретинопатії на цій моделі тварин із діабетом 2 типу, яка імітує нормальний розвиток та метаболічні особливості діабету 2 типу людини. Ми досліджували патологію судин сітківки та функціональні зміни на моделі щурів з високим вмістом жиру від 2 до 6 місяців після індукованої Stz гіперглікемії та порівнювали її з моделлю щурів діабету 1 типу. Щоб зрозуміти молекулярний механізм, оцінюють пошкодження мітохондрій та епігенетичні модифікації мтДНК та промотору Rac1 в мікрососудах сітківки на цих моделях тварин з діабетом.

Дизайн та методи дослідження

Самців щурів Sprague Dawley (віком від 9 до 10 тижнів) розділили на дві групи; в той час як щури в групі 1 залишались на звичайній щурячій чау (каталожний номер 7001; Envigo, штат Індіанаполіс, штат Індонезія), що містить 4,25% ккал у вигляді жиру, щурів групи 2 поміщали на дієту з високим вмістом жиру (номер каталогу D12451; Нью-Брансвік, Нью-Джерсі), що містить 45% ккал у вигляді жиру. Через 8 тижнів на дієті з високим вмістом жиру половина щурів отримувала низьку дозу Stz (30 мг/кг маси тіла [BW] i.p.) для індукування діабету (T2D) (21,22). Одночасно половині щурів, які отримували регулярний чау-щур (група 1), також вводили 60 мг/кг БТ Stz (T1D) (16), а інша половина залишалася нормальним контролем (Норма); у кожній групі було 12–16 щурів. Протягом усього експерименту щури в групах T2D та HF підтримувались на одній і тій же дієті з високим вмістом жиру, а групи T1D та Norm - на нормальній чау-щурі. Їх приносили в жертву через 2, 4 і 6 місяців після введення Stz. Поводження з тваринами відповідало вимогам Асоціації дослідників зору та офтальмології щодо використання тварин у офтальмологічних та зорових дослідженнях та відповідало нашим інституційним рекомендаціям.

Толерантність до глюкози та резистентність до інсуліну

Щурів голодували протягом ночі, зважували і вводили глюкозу (2 г/кг т. Д. Внутрішньовенно). Глюкозу в крові вимірювали за допомогою смужок реагентів глюкозо-оксидази безпосередньо перед і через 15–180 хв після введення глюкози (22).

Чутливість до інсулінорезистентності визначали шляхом введення препарату Гумулін R (1 МО/кг перорального в/в) (Eli Lilly and Company, Індіанаполіс, штат Індонезія) та вимірювання рівня глюкози в крові через 0–180 хв після введення інсуліну (23).

Ліпідний профіль сироватки

Кількісно визначали рівень холестерину та тригліцеридів у сироватці крові за допомогою комерційних наборів від Abcam (каталожні номери ab65390 та ab65336; Cambridge, MA), як описано раніше (8).

Мікросудини сітківки

Сітківку суспендували в 15-20 мл деіонізованої води та інкубували у водяній бані на шейкері протягом 1 години при 37 ° С. Після видалення некапілярної тканини шляхом багаторазового вдиху та викиду препарат промивали стерильним PBS (24,25). Кожен препарат мікросудин включав сітківку з груп Norm, T1D, T2D та HF.

Мікросудинна гістопатологія

Всю сітківку ізолювали від зафіксованих формаліном очей і після промивання протягом ночі в проточній воді інкубували протягом 45–70 хв при температурі 37 ° C у 3% неочищеному трипсині (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY), що містить 200 моль/л фторид натрію. Очищену судинну рідину фарбували гематоксиліном періодичної кислоти Шиффа (PAS) (номер за каталогом 395B; Sigma-Aldrich), а безклітинні капіляри та привиди перицитів підраховували під мікроскопом (8,26).

Електроретинограма

Електроретинограму (ЕРГ) проводили у щурів, пристосованих до темряви, знеболених кетамін-ксилазином. Зіницю розширили офтальмологічним розчином тропікаміду, і після змазування рогівки Goniovisc, реакції ЕРГ вимірювали за допомогою Ocuscience HMsERG. Використовували спалахи Ганцфельда з інтенсивністю від 100 до 25000 мкд/с2, і реєстрували відповіді ERG. Амплітуди та неявні часи хвилі b вимірювали за допомогою програмного забезпечення ERGView (8,26).

Експресія генів

Для синтезу кДНК використовували РНК, виділену з мікросудин за допомогою реагенту TRIzol. Транскрипти генів оцінювали за допомогою кількісної ПЛР на основі SYBR Green (qPCR), використовуючи специфічні для генів праймери (Додаткова таблиця 1). β-актин використовували як ген ведення домашнього господарства, а зміну складки обчислювали за допомогою методу ΔΔ порогового циклу.

Номери збитків і копій mtDNA

Для пошкодження mtDNA довгі (13,4 kb) і короткі (210 bp) ділянки mtDNA ампліфікували в геномній ДНК, отриманій з мікросудин сітківки, за допомогою напівкількісної ПЛР, і продукти розчиняли на 2% агарозному гелі. Відносне посилення кількісно визначали шляхом нормалізації інтенсивності довгого продукту до короткого (17).

Кількості мітохондріальних копій визначали в геномній ДНК, визначаючи співвідношення кодованого мтДНК гена цитохрому B (CytB) та кодованого β-актину, що кодується ядерною ДНК (27).

Загальний рівень АФК вимірювали в мікросудинах сітківки (від 4 до 5 мкг білка) флуориметрично, використовуючи 2 ′, 7′-дихлорфлуоресцин діацетат (номер за каталогом D6883; Sigma-Aldrich) (8).

Rac1 Activity

Набір для колориметричного аналізу G-LISA (номер за каталогом BK-128; Cytoskeleton, Inc., Denver, CO) був використаний для кількісної оцінки активності Rac1 у білках 20–25 мкг (8,28). Значення з групи норм розглядалися як 1.

Метилювання ДНК

Кількісно визначали 5-метилцитозин (5mC) при D-Loop та 5-гідроксиметилцитозин (5hmC) на промоторі Rac1 в імунопреципітованій геномній ДНК з використанням наборів для метильованої та гідроксиметильованої ДНК для імунопреципітації EpiQuik (каталогічні номери P-1015 та P-1038, відповідно, від EpiGentek, Farmingdale, NY), як описано раніше (19,24).

Зв'язування Tet2, Dnmt1 або фактора транскрипції ядерного фактора -κB (NF-κB) (субодиниця p65) на промоторі Rac1 визначали за допомогою аналізу імунопреципітації хроматину (19,24), використовуючи IgG як контроль антитіл. Антитіла, що використовуються для імунопреципітації - Tet2 (номер за каталогом ab135087), Dnmt1 (номер за каталогом ab13537), p65 (номер за каталогом ab7970) та IgG (номер за каталогом ab171780) - були отримані від Abcam.

Діяльність тетів

Набір EpiQuik Epigenase 5mC-Hydroxylase TET Activity/Inhibit Assay Kit (каталожний номер P-3087; EpiGentek) використовували для визначення активності Tets в ядерній фракції сітківки (15–20 мкг білка), як було описано раніше (19).

Статистичний аналіз

Дані представлені як середні значення ± SD. Порівняння між групами проводили за допомогою одностороннього ANOVA з подальшим тестом Данна; P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Метаболічні параметри

Толерантність до глюкози до та після індукції діабету. Толерантність до глюкози оцінювали у щурів, що голодували протягом ночі, які дотримувались нормальної дієти на чау чи жирних стравах до (A) та 2, 4 та 6 місяців після (B – D) введення Stz. E: Чутливість до інсулінорезистентності оцінювали шляхом вимірювання глюкози у щурів після введення гумуліну R (1 МО/кг т. Д.). Кожен графік представляє 7–9 щурів у кожній групі.

Хоча групи T1D, HF та Norm мали однакову кількість безклітинних капілярів та привидів перицитів протягом 4 місяців, у групі T2D вони були значно вищими. Однак у 6 місяців діабету гістопатологія була порівнянна у групах T1D та T2D, з однаковим числом безклітинних капілярів та привидів перицитів у їх судинній системі сітківки (рис. 2A та B). Фіг.2С і D представляють забарвлену PAS мікроваскуляру сітківки, засвоювану трипсином від щурів на діабеті 4 та 6 місяців відповідно.

Одним обмеженням цього дослідження є використання лише щурів-самців, і не можна виключати можливість того, що в подібних експериментальних умовах у самок щурів не може розвинутися ретинопатія, або тяжкість гіперглікемії/гіперліпідемії та ретинопатії може бути вищою, ніж у щурів-самців. . Крім того, механізм розвитку діабетичної ретинопатії у самок щурів може відрізнятися від механізму, запропонованого в цьому дослідженні для щурів-самців; майбутні дослідження будуть зосереджені на вирішенні статевих варіацій у цій новій моделі діабетичних тварин типу 2 з ретинопатією.

Ожиріння розглядається як сильний фактор ризику діабету 2 типу, і в цьому дослідженні ми чітко продемонстрували розвиток ретинопатії на тваринній моделі, в якій ожиріння супроводжується гіперглікемією, що точно імітує загальну популяцію пацієнтів з діабетом 2 типу. На епігенетичні модифікації значний вплив мають зовнішні фактори, включаючи фізичні вправи та дієту, і ми показуємо, що ожиріння/гіперліпідемія додатково посилює епігенетичні модифікації mtDNA та промотору Rac1, прискорюючи пошкодження мітохондрій та розвиток діабетичної ретинопатії. Таким чином, стратегії, орієнтовані на підтримку хорошого способу життя та ІМТ, крім покращення гіперліпідемії, можуть також бути корисними для регулювання епігенетичних модифікацій та запобігання/уповільнення ретинопатії у пацієнтів з діабетом.

Інформація про статтю

Подяка. Автор дякує доктору Дуресамі та доктору Суніті (Університет Уейна) за допомогу в початкових експериментах та докторам Мохаммаду та Джині Полсінеллі (Університет Уейна) за аналіз гістології та технічної допомоги відповідно.

Фінансування. Це дослідження було частково підтримано грантами Національного інституту очей (EY014370, EY017313 та EY022230) та Фонду Томаса R.A.K. та необмежений грант з наукових досліджень для запобігання сліпоти для офтальмологічного відділу Університету Уейна.

Подвійність інтересів. Не повідомлялося про потенційні конфлікти інтересів, що стосуються цієї статті.