Гомологічна рекомбінація: інструмент редагування геному дріжджів GRAS

Годинник 1890 року. (A) Вид спереду та (B) хитромудра внутрішня робота шестірні механічного годинника в поєднанні з музичним годинником.

(A) Порівняння гомологічної рекомбінації (HR) та негомологічного кінцевого з'єднання (NHEJ). З нагоди розриву дволанцюжкової ДНК існує два можливі механізми відновлення. HR (ліва панель) вимагає створення шаблону, займає кілька годин, але є надзвичайно точним і порівнянним із комп’ютерною командою “скопіювати + вставити”. NHEJ (права панель) не вимагає шаблону, схильний до помилок, але швидший і може бути пов'язаний з мотузковим вузлом. (B) Схематичний огляд механізмів HR (ліворуч) та NHEJ (праворуч). HR: після резекції ланцюгів ДНК екзонуклеазою, Rad51 та інші білки утворюють нуклеопротеїновий комплекс, який шукає і вторжується в шаблонну ланцюг, утворюючи D-петлю. Петля переміщення може бути вирішена шляхом синтезозалежного відпалу нитки (внизу ліворуч), що не призводить до перехрещення. Ремонт подвійного ланцюга може вирішити святкові сполучення або кросовером (показано), або не кросовером. NHEJ: димер білка Ku70/Ku80 захищає кінці ДНК від деградації/резекції та вербує, наприклад, ДНК-залежну каталітичну субодиницю протеїнкінази (DNA-PK). Сестринські хроматиди представлені двома стрілками відповідно червоним і синім кольорами. Світлий і темний кольори розрізняють нитки ДНК. Стрілки вказують на 5′-3 ′ орієнтацію ланцюгів ДНК, а штрихові лінії представляють новосинтезовану ДНК.

Перемикач типу спарювання у Saccharomyces cerevisiae. (А) Тип клітини у S. cerevisiae визначається локусом MAT. У клітинах є алель у локусі MAT, тоді як α клітини мають MAT α. Локус MAT знаходиться на CHRIII. На теломерних кінцях цієї хромосоми є мовчазні касети обох типів спарювання, HML α ліворуч і HMR a праворуч. (B) Переключення типу спарювання ініціюється ендонуклеазою Ho, яка розщеплюється на певній ділянці на межі області Y-Z, утворюючи дволанцюгову розрив (DSB). Це ініціює конверсію генів, використовуючи, з високою точністю, протилежну тиху касету типу спаровування як шаблон для відновлення DSB, що призводить до перемикання типу спарювання [51].

Націлювання генів на основі ПЛР. (А) Касета з руйнуванням із селективним маркерним геном (MARKER), фланкирована 5'- та 3'-гомологічними областями (HR1, HR2), отримується за допомогою ампліфікації ПЛР і трансформується в дріжджові клітини. HR1 та HR2 пряма рекомбінація в локус-мішень YFG ("ваш улюблений ген"). (B) Маркерна касета тепер інтегрована в локус.

Редагування геному за допомогою CRISPR/Cas9. Cas9 - ендонуклеаза рестрикції (зображена ножицями), яка вводить DSB у цільову послідовність, визначену напрямною РНК. Направляючі основи РНК з послідовністю протоспасера і Cas9 розрізають, якщо присутній сусідній мотив протоспазера (PAM, тут NGG, необхідний для Streptococcus pyogenes Cas9).

Подрібніть шестерні винних та пивних дріжджів. Складність ароматичного профілю можна покращити, тобто, порушивши ген α-ацетогідроксикислоти-синтази ILV2, зменшивши вироблення діацетилу («смак вершкового масла») або посиливши вироблення ароматичного ацетату («аромат банана»), надмірно виражаючи алкогольно-ацетильний трансферази, кодовані ATF1 або мутований LEU4, ключові ролі ферментів у шляху біосинтезу лейцину. Надмірна експресія аміноліази сечовини, кодованої DUR1,2, зменшує вироблення сечовини, а отже і етилкарбамату (уретану), який обговорював канцерогенний ризик. Гетерологічна експресія S. pombe mae1 та O. oeni mleA дозволяє дріжджам засвоювати малат і перетворювати яблучну кислоту в молочну, відповідно, уникаючи необхідності додавати бактерії до ферментативних партій. Вичерпне читання про зміни геному у винних дріжджах див. [97].

Анотація

1. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae - супутник століть

триплоїдні штами I групи, включаючи S. carlsbergensis та

тетраплоїдні штами ІІ групи, включаючи S. pastorianus, що мають спільне походження [20,21]. Джуліус Вортман, працюючи в Науково-дослідному інституті Гейзенгейма, натхненний роботою Гансена, сприяв ізоляції та характеристиці винних дріжджів у 1890-х роках, деякі з яких і сьогодні використовуються для винного бродіння [22].