Порівняльне дослідження антиоксидантної активності сироватки крові людини амперометричним, вольтамперометричним та хемілюмінесцентним методами

Євген Плотніков

1 Томський політехнічний університет, Томськ, Росія

Олена Короткова

1 Томський політехнічний університет, Томськ, Росія

Олеся Воронова

1 Томський політехнічний університет, Томськ, Росія

Наталія Сажина

2 Інститут біохімічної фізики Емануеля, Москва, Росія

Катерина Петрова

1 Томський політехнічний університет, Томськ, Росія

Антон Артамонов

3 Фламена Лтд, Москва, Росія

Людмила Чернявська

4 Сибірський державний медичний університет, Томськ, Росія

Олена Дорожко

1 Томський політехнічний університет, Томськ, Росія

Анотація

Вступ

Аналіз крові може надати важливу інформацію про функціональний стан антиоксидантної системи. Порушення роботи цієї системи збільшує концентрацію вільних радикалів і може спричинити окислювальний стрес. Труднощі в оцінці окисного стресу полягає у відсутності універсального методу визначення антиоксидантної активності (АОА) компонентів крові через їх різну природу.

Матеріал і методи

Об'єктами дослідження були сироватки 30 пацієнтів чоловічої статі з діагнозом синдром алкогольної залежності та здорові донори. Порівняльне дослідження загальної антиоксидантної активності (TAA) сироватки крові людини проводили вольтамперометричним (VA), амперометричним (AM) та хемілюмінесцентним (HL) методами.

Результати

Всі застосовані методи виявили, що сироватковий TAA у хворих на алкоголізм нижчий, ніж TAA у здорових донорів (контрольна група); за амперометричним методом середнє значення сироваткового TAA становило 850 ± 210 нА × с та 660 ± 150 нА × с для здорових донорів та алкоголіків відповідно (p Ключові слова: загальна антиоксидантна активність крові, алкоголізм

Вступ

Аналіз крові надає вичерпну інформацію про внутрішні умови та процеси. Одним із важливих параметрів є функціональний стан антиоксидантної системи. Порушення роботи цієї системи підвищує концентрацію вільних радикалів (супероксид-аніонний радикал та гідропероксидний радикал, гідроксильний радикал та ін.), Надлишок яких викликає окислювальний стрес і бере участь у патогенезі ряду захворювань [1–3]. У свою чергу, хвороби, фактори навколишнього середовища та стрес призводять до того, що природна антиоксидантна система організму не здатна ефективно нейтралізувати радикали, що спричинює більш сильний окислювальний стрес. Однак різні біологічні фактори, а також різні методи аналізу призводять до значних змін у виявлених параметрах крові антиоксидантної системи. Труднощі в оцінці окисного стресу полягає у відсутності універсального методу визначення антиоксидантної активності компонентів крові через їх різну природу. Огляд [4] показав низьку кореляцію між найбільш відомими методами оцінки антиоксидантної активності, що дозволяє говорити лише про якісні характеристики результатів аналізу.

Метою даної роботи було провести порівняльну оцінку загальної антиоксидантної активності (TAA) крові сироватки людини в здорових умовах та при патології (синдром алкогольної залежності) амперометричним, хемілюмінесцентним та вольтамперометричним методами. Алкоголізм, як правило, характеризується психічною та фізичною залежністю від етанолу, що пов'язано зі зміною біохімічних показників у крові пацієнта. Загальну концентрацію сполук тіолу визначали в тих самих зразках, як додатковий параметр, який також описує стан антиоксидантної системи.

Матеріал і методи

Об'єктом дослідження була сироватка 30 пацієнтів чоловічої статі з діагнозом синдром алкогольної залежності. Усі пацієнти знаходились під медичною допомогою в Томській обласній психіатричній лікарні. Як контрольну групу використовували сироватку крові здорових донорів.

Попередня обробка зразків крові

Венозну кров, зібрану натще, поміщали в скляну пробірку для центрифуги без антикоагулянта і залишали при кімнатній температурі на 30 хв, щоб забезпечити утворення згустку, який негайно видаляли. Пробірки центрифугували в настільній центрифузі протягом 10 хв при швидкості обертання 2000 об/хв. Для подальшого вивчення відібрали центрифугат в обсязі 1,0–1,5 мл.

Метод хемілюмінесценції (ХЛ)

Вольтамперометричний метод (ВА)

Основним принципом вольтамперометричного методу визначення загальної антиоксидантної активності в сироватці крові є реєстрація зниження кисню у вольтамперограммах з додаванням і без додавання зразків сироватки (0,1 мл). Модельна реакція - це процес електровосстановлення кисню (O2 ER), розчиненого в підтримуючому електроліті в діапазоні потенціалів від 0 до –1,0 В. Цей процес ідентичний відновленню кисню в живих клітинах і тканинах тіла.

У методі VA ми використовували коефіцієнт антиоксидантної активності (в мкмоль/л × хв) речовин, який відображає кількість активних кисневих радикалів, що вступили в реакцію з антиоксидантами протягом певного періоду часу, за формулою:

Амперометричний метод (АМ)

Амперометричний підхід оцінки АОА заснований на вимірюванні електричного струму, що виникає при окисленні досліджуваної речовини на поверхні робочого електрода з певним потенціалом.

Статистичний аналіз

Розраховували середні та стандартні похибки середнього значення. Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Statistica 6.0. Для статистичного аналізу даних використовували t-критерій Стьюдента. Середні зміни коефіцієнтів антиоксидантної активності сироватки людини розраховували для хворих на алкоголізм та здорових донорів (контрольна група). Дані представлені як середнє значення ± SD.

Результати

Дослідження загальної антиоксидантної активності сироватки крові вольтамперометричним методом виявило зменшення кисневого катодного струму та зсув хвильового потенціалу ER O2 у бік позитивних значень після додавання зразків крові у фоновий розчин. Це вказувало на антиоксидантну активність зразка і дозволяло розрахувати загальний коефіцієнт АОА. Результати аналізу сироватки крові амперометричним методом показані на рисунку 1. Ця амперограма має нехарактерну двогорбу форму, тоді як для окремих фенольних речовин завжди спостерігалася одногорба. Ймовірно, це пов’язано з тим, що окислення низькомолекулярних компонентів сироватки крові, пов’язане з білками, забезпечує другий пік через часткове розділення розчину на різні фракції при проходженні через капіляри та амперометричну клітину.

Амперограма попередньо оброблених зразків сироватки з двогорбою формою струмових кривих (методом поточно-ін'єкційного аналізу з амперометричним виявленням)

Значне зниження антиоксидантної активності алкоголіків у сироватці порівняно зі здоровими донорами було відзначено за методом CL. На малюнку 2 показана динаміка люмінесценції для різних обсягів зразків (v, мкл) донора (A) та алкоголіків (B), доданих до клітини хемілюмінесценції. Метод CL виявив найбільшу різницю в TAA сироватки між алкоголіками та здоровими донорами (порівняно з іншими методами). Залежність між відносним прихованим періодом (t/t 0) випромінювання CL та вхідним об'ємом зразка до комірки (v, мкл) добре відзначається як нахил ліній. Він відображає TAA зразка.

Інтенсивність викидів CL (I) від часу процесу (t). Динаміка викидів CL для різних обсягів сироватки ((1) - 0 мкл; (2) - 2 мкл; (3) - 3 мкл; (4) - 5 мкл) здорових донорів (A) та алкоголіки (B)

Низька концентрація антиоксиданту в крові алкоголіків призводить до короткого прихованого періоду хемілюмінесценції (рис. 2 Б). Сироватки здорових донорів мають вищу антиоксидантну здатність, що проявляється як тривалий латентний період та поступовий нахил інтенсивності хемілюмінесценції (рис. 2 А).

Середні значення антиоксидантної активності в сироватці крові, отримані всіма використовуваними методами, представлені на малюнку 3 .

Середні значення (середнє значення ± SD) загальної антиоксидантної активності та загального вмісту тіолових сполук у сироватці крові здорових донорів та пацієнтів з діагнозом алкоголізму за методами VA, CL та AM (p Рисунок 3. Обидва параметри нижчі у у випадку алкоголізму. Також повідомлялося про пряму кореляцію між загальною антиоксидантною здатністю (вираженою як FRAP) та концентрацією групи -SH у сироватці крові пацієнтів [11]. Наше дослідження показало, що середня концентрація тіолів становила 0,94 ± 0,34 ммоль/л ( p Рисунок 3). Огляд [13] повідомляє про подібні зміни в крові алкоголіків, включаючи низький рівень дієтичних антиоксидантних вітамінів, таких як вітамін С та вітамін Е, та ендогенних антиоксидантів, таких як глутатіон крові. Зниження концентрації тіолів призводить до недостатнього антиоксидантна система крові у алкоголіків. Можливо, такий стан можна було б виправити спеціальними добавками антиоксидантів, як повідомлялося раніше [14]. Антиоксидантні добавки можна враховувати d як важливий компонент для комплексного лікування алкоголізму.

На закінчення результати експериментальних досліджень показують, що запропоновані методи можуть бути використані в діагностичних цілях. Усі методи виявили значне виснаження сироваткової антиоксидантної активності при алкоголізмі. Це може бути ознакою алкогольного окисного стресу. Показники загальної антиоксидантної активності сироватки крові значною мірою залежать від початкового стану здоров'я пацієнта. Однак для об'єктивної оцінки антиоксидантної активності біологічних об'єктів доцільно використовувати кілька аналітичних методів, заснованих на різних модельних системах.

Подяка

Дослідження підтримано Російським фондом фундаментальних досліджень, дослідницький проект № 15-04-0111.

Конфлікт інтересів

Автори не заявляють конфлікту інтересів.