Побудова генетичної карти рилів, отриманих із сортів пшениці (T. aestivum L.) pamyatii azieva x paragon із використанням високопродуктивної платформи генотипування snp kasp - конкурентна алель специфічна ПЛР

Анотація

Основними цілями дослідження були i) розробка першого картографування популяції хлібної пшениці, вирощеної в Казахстані, ii) побудова її генетичної карти для подальшої ідентифікації генів, пов’язаних з важливими агрономічними ознаками.

Наскільки нам відомо, це перша сегрегуюча популяція та генетична карта, розроблена для казахської хлібної пшениці. Ця робота є прикладом того, як програми розведення рослин у Казахстані почали успішно застосовувати методи розведення рослин наступного покоління.

Технологія KASP (Compatative Allele Specific PCR) LGC Group та SNP-маркери SNP були використані для генотипу та побудови генетичної карти сегрегуючої популяції. Загальна довжина карти становила 1376 см. Загалом 157 із початкових 178 використаних маркерів SNP утворили 26 груп зв’язків, залишивши 1 дубльований і 20 неприсвоєних маркерів. Порогова відстань між маркерами була встановлена ≤ 30 см. Отже, були отримані дві групи зв’язку для хромосом, таких як 2A, 2B, 2D, 3A, 5A, 6B та 7A. Незважаючи на один продубльований та 20 неприсвоєних маркерів, 157 нанесених на карту маркерів SNP KASP охоплювали геноми A, B та D пшениці. Для обчислення одиниць рекомбінації між виробниками застосовували функцію відображення Косамбі. RIL були розроблені методом SSD до покоління F4. Майже 97% виявлених алелів були корисними для оцінки генетичного різноманіття популяції; решта 3% не показали результату. Як результат, 77 маркерів ДНК було нанесено на карту для A, 74 для B і 27 для геномів D. Популяція для картографування буде генотипована за допомогою форми форми масиву з високою щільністю маркерів, такої як Illumina iSelect, для отримання генетичної карти з відносно високим охопленням. Потім генетична карта популяції та високої роздільної здатності буде використана для ідентифікації генів, що впливають на адаптацію пшениці в Казахстані.

Вступ

Пшениця - це зернова культура. Незважаючи на те, що існує багато дещо відмінних теорій його походження, Родючий Півмісяць вважається головним чином місцем, де виникла та була одомашнена пшениця (CW 1995) (Nesbitt and Samuel 1998) (Gustafson, Raskina et al. 2009 ). Три геноми (AABBDD) гексаплоїдної пшениці (Triticum aestivum L. ssp. Aestevium), отримані з диплоїдного (DD) Aegilops tauschii та тетраплоїдного (BBAA) дикого еммеру (Triticum turgidum L. (Tell), ssp. Dicoccoides), які, у свою чергу, успадкували його геном АА з диплоїдного Triticum urartu та ВВ або з диплоїдного Aegilops speltoides, або з деяких інших вимерлих видів (Wang, Luo et al. 2013) (Feldman, Liu et al. 1997). З часу його вирощування хлібна пшениця була культурою великого значення, яка в даний час забезпечує 20% загальної кількості калорій населення світу (Бушук 1997). Отже, гексаплоїдна (2n = 6x = 42) хлібна пшениця з найскладнішим геномом та походженням історії є життєво важливою продовольчою та кормовою культурою у світі. Її важливість особливо висока в Казахстані, оскільки i) більшість місцевих дієтичних продуктів складалася з пшеничного борошна (Eken, Spanbayev et al. 2016) ii) Казахстан є одним із трьох гігантських світових експортерів пшениці, який в даний час входить до числа чотирьох основні експортери пшениці, які в сукупності відомі як світові країни «хлібного кошика», а також Україна та Росія (Swinnen, Burkitbayeva et al. 2017).

Матеріали і методи

Розвиток сегрегуючої/картографічної популяції

Вилучення ДНК з Pam x Par RIL та підготовка ДНК для генотипування за допомогою KASP

Для вилучення ДНК з рекомбінантних інбредних ліній п’ять насінин кожної лінії висівали в чашки Петрі і ставили на 2 дні при 4 ° С для стратифікації. Після цього їх переносили в інкубатор із температурними режимами 27-30 ° C протягом 5-6 днів для проростання. Методологія Dellaporta (Dellaporta, Wood et al. 1983), зі змінами, була використана для виділення ДНК із 5-6-денних саджанців пшениці. Вилучену геномну ДНК піддали подальшому очищенню з використанням спінальних колонок Qiagene Mini. Якість та кількість (A260/A280) вилученої ДНК оцінювали на спектрофотометрі Nanodrop з подальшою візуалізацією на 1% агарозних гелях для оцінки цілісності. ДНК кожного RIL була стандартизована до концентрації 10 нг/мкл для генотипування за допомогою платформи KASP. Головним пріоритетом платформи генотипування KASP перед старими системами є те, що вона не вимагає багато часу для візуалізації продукту ПЛР. Таким чином, це надзвичайно полегшило старий трудомісткий метод візуалізації, електрофорез на основі гелю, який використовує мутагенні вологі хімікати, такі як бромід етидію. Крім того, за допомогою технології KASP також можна виявити унікальні вставки, делеції та зміни однієї основи (один нуклеотид) в геномах, що робить його потужним інструментом для заміни старого нудного методу.

Побудова генетичної карти

Спочатку для генотипу Памяті Азієвої та Парагона використовували більше трьохсот маркерів ДНК SNP, розроблених Бристольським університетом (інформацію про ДНК-маркери можна отримати тут www.cerealsdb.uk.net (Wilkinson, Winfield et al. 2012)). Це незалежно від того, були ці молекулярні маркери поліморфними чи ні. Після виявлення поліморфних маркерів, які генетично відрізняють батьків, вони були використані для генотипу популяції RIL. Для побудови генетичної карти зв’язків RIL спочатку використовувалося програмне забезпечення MapDisto (http://mapdisto.free.fr/) (Heffelfinger, Fragoso et al. 2017). Однак відстань генетичної карти було переоцінено за допомогою універсального статистичного програмного середовища R. Причина полягає в тому, що R є гнучким інструментом для проведення статистичних розрахунків для набору даних для покращення якості генетичної карти. В обох випадках функцію відображення Косамбі (Kosambi 2016) використовували для обчислення фракцій рекомбінації, а потім, перетворення одиниць в сантиМоргани. Логарифм шансів (оцінка LOD) був не нижче трьох. Загалом 72 молекулярні маркери SNP були нанесені на карту A, 67 - на B і лише 19 - на геноми D, що свідчить про важливість розвитку більш поліморфних маркерів для геному D для використання його генетичного потенціалу для аналізу асоціації маркер-ознака. Не було відмічено жодних маркерів для 3D та 4D хромосоми пшениці (Таблиця 1).

У таблиці вказано кількість маркерів, довжину, середній інтервал між маркерами та максимальну відстань між маркерами для кожної хромосоми або груп зв’язків з аналізу. Для 3D та 4D хромосоми пшениці не було відмічено жодних маркерів.

Порогова відстань була встановлена не вище 30 сМ між ДНК-маркерами вздовж груп зчеплення (LG). Отже, дві LG були отримані, якщо довжина між двома сусідніми ДНК-маркерами при парному аналізі перевищує 30 см. Іншими словами, якщо фракція рекомбінації між двома маркерами> 0,30%, утворюється більше зв’язкових груп.

Основна статистика

Результати

Розвиток популяції та побудова генетичної карти

Тут ми повідомляємо про розвиток сегрегуючої популяції, отриманої від схрещування сортів пшениці Paragon та Pamyati Azieva, зокрема рекомбінантних інбредних ліній (RIL), та побудови першої генетичної карти RIL у співпраці між Центром Джона Іннеса (JIC) Великобританія та Інститут біології рослин та біотехнологій (IPBB), Казахстан. Це заслуговує на увагу, оскільки це перша розроблена картографічна популяція та коли-небудь побудована генетична карта, що включає сорт пшениці, пристосований до основних середовищ вирощування пшениці в Казахстані, використовуючи сучасну технологію молекулярних маркерів. В результаті було отримано 94 рекомбінантні інбредні лінії, а загальна довжина побудованої генетичної карти становила 1376 см. Загальна кількість відображених маркерів SNP KASP становила 157, які знаходяться в 26 зв’язкових групах. Найбільшою групою зв'язків була група зв'язків 1 для хромосоми 1А із розміром карти 174 см. Навпаки, група зв’язку 3 для 1D хромосоми була найменшою за розміром, лише 1 см. Група зв’язку 17 із загальним розміром карти 133 см та максимальним інтервалом 23 см була найщільнішою, призначаючи 15 молекулярних маркерів (табл. 1 та S.5). Загальна кількість неприсвоєних маркерів становила 20 (не показано).

Виділення ДНК

ДНК витягували з п’яти- і шестиденних саджанців, вирощених в інкубаторі з діапазоном температур 20-22 ° С. Щодо результатів Nanodrop (дані не надані) кількість виділеної ДНК в середньому перевищувала 100 мкл/нг, а якість коливалась між 1,8 - 2,0 (A260/A280) після очищення за допомогою спінових колонок Qiagene Mini. Оскільки KASP вимагає меншої концентрації ДНК для встановлення ПЛР порівняно зі звичайною ПЛР, ДНК кожної рекомбінантної лінії розбавляють окремо дистильованою водою, отримуючи ДНК з кінцевою концентрацією 10 нг/мкл.

Загальна статистика

Підсумок функції () показав, що тип хреста був “riself”, як очікувалось, із значенням RIL, отриманих шляхом самозапліднення. Оскільки порогова відстань між маркерами була встановлена не вище 30 сМ, були отримані дві групи зв’язку для хромосом, таких як 2A, 2B, 2D, 3A, 5A, 6B і 7A. Отже, загальна кількість хромосом становила 26, а генотипованих маркерів - 157, за винятком одного з двох дублюючих маркерів, BS00090234 та BS00022781, з однаковими маркерними генотипами. Ці повторювані маркери, розташовані в групі зв’язків 2B2, були ідентифіковані функцією findDupMarkers (), а один, особливо BS00022781, був пропущений у подальшому аналізі за допомогою drop.markers (). Таким чином, побудована карта містила 26 LG, а саме 1A (з 10 маркерами ДНК SNP), 1B (11), 1D (2), 2A1 (6), 2A2 (3), 2B1 (2) 2B2 (7), 2D1 (4), 2D2 (5), 3A1 (5), 3A2 (2), 3B (13), 4A (9), 4B (3), 5A1 (10) 5A2 (5), 5B (15), 5D (4), 6A (11), 6B1 (5), 6B2 (2), 6D (2), 7A1 (3), 7A2 (8), 7B (8) та 7D (2) (табл. 1).

Для складання генетичної карти з усіма алелями та відсутніми генотипами як теплової карти була використана функція geno.image (), але дані трактувались як генерація F2. В результаті побудови точок даних спостерігався прийнятно низький рівень зниклих генотипів, який спостерігався як для особин, так і для маркерів, тому не було підстав скидати ні особин, ні маркери (ФІГ.1). Зверніть увагу, що слід читати набір даних у R як генерацію f2, щоб побудувати графік усіх алелів та відсутніх даних для інбредних ліній, отриманих шляхом самозапліднення. Якщо набір даних розглядається як самозапліднені інбредні лінії, програма відображає гетерозиготи як відсутні генотипи. Тому в наборі даних може з’явитися більше відсутніх даних. Функція plotMissing () у пакеті R-QTL потенційно може бути використана для здійснення того самого аналізу, але вона не надає інформації про гаплотип (алель). Тому в ньому побудовано лише відсутні генотипи, і тому ми рекомендуємо застосувати geno.image (), щоб надати цілісну картину карти.

Генетична карта тепла: червоний, синій та зелений стосуються алелів AA, BB та AB відповідно. У білих прогалинах відсутні генотипи. Уздовж верхньої та нижньої осей х розташовані відповідно групи зв’язків та маркери. Горизонтальні лінії зверху вниз розділені групи зв'язків. Зразки залиті на осі y.

Рівень успішності генотипування становив 96,5%, при цьому 3,5% бракувало даних. Якщо взяти відсоток генотипу як 100%, частка алелей АА та ВВ склала б відповідно 47,7% та 47,2%, що майже однаково з рештою 5,1% гетерозигот (АВ) (ФІГ.2 та S.4). Графік чисел генотипізованих/відсутніх маркерів для кожної особини та чисельності генотипованих/відсутніх зразків для кожного виробника за допомогою функції ntyped () чітко показав, що майже всі особи генотипіровані з більш ніж 140 маркерами із 157, за винятком лише з трьох особин, PamxPar-89, PamxPar-49 та PamxPar-48, які мали 135, 136 та 137 генотипованих маркерів відповідно. Був лише один маркер, BS00060014, з понад 30 відсутніх генотипів/зразків із 94 (ФІГ.3 та S.1). Це підтверджує, що нам не потрібно пропускати будь-яку особу та маркер з аналізу, оскільки ці незначні відсутні дані (відсутні генотипи як для особини, так і для маркера) не повинні викликати труднощів.

Частка алелів АА та ВВ була майже однаковою (47,7% та 47,2% відповідно). На відміну від цього, генотипи AB складали лише 5,1%, як очікувалося у F4, що свідчить про те, що популяція в основному була зафіксована на більшості маркерів.

В результаті функції порівняння, ми побачили, що Інбредні лінії, отримані з схрещування PamxPar, мають приблизно 40% генотипів у маркерів. Ми також могли бачити осіб з дуже схожими генотипами, у яких більше 90%. Крім того, були виявлені особи з майже подібними генотипами, RIL30 з RIL31 (частка 92,3% генотипів), RIL58 з RIL61 (90,1%) та RIL41 з RIL62 (90,2%) (ФІГ.4 та S.2).

Кількість генотипованих маркерів для кожного зразка (ліворуч) та кількість генотипованих особин для кожного маркера (праворуч).