Первинний альдостеронізм та порушення натрійурезу у мишей, що не виражають TGFβ1

  • Знайдіть цього автора на Google Scholar
  • Знайдіть цього автора на PubMed
  • Шукайте цього автора на цьому сайті
  • Для листування: mkakoki @ med.unc.eduoliver_smithies @ med.unc.edu

Автор: Олівер Смітіс, 15 лютого 2013 р. (Направлено на огляд 23 січня 2013 р.)

мишей

Ця стаття має виправлення. Дивіться:

Анотація

Трансформуючий фактор росту β1 (TGFβ1), прототипний член надродини TGFβ, є потужним багатофункціональним цитокіном, що впливає на широкий спектр біологічних процесів, включаючи проліферацію клітин, апоптоз, придушення пухлини, старіння (1, 2), диференціацію (3), міграція (4), імунітет (5), остеогенез (6), адипогенез (7) та загоєння ран (8).

Чи грає TGFβ1 якусь роль у контролі артеріального тиску (АТ), поки чітко не продемонстровано. Мишей було створено, яким повністю не вистачає TGFβ1 (9, 10), але їх смерть від важкого запального захворювання навколо відлучення виключає вимірювання АТ. Запальне захворювання та ранню смерть можна обійти, якщо мишам також не вистачає функціональних Т і В-клітин в результаті інактивації активуючого рекомбінацію гена Rag1 (11). На жаль, інактивація Rag1, окремо або у поєднанні з неактивним Tgfb1, порушує роботу систем, що контролюють АТ (12). У людини алель 915C з однонуклеотидним поліморфізмом у TGFB1, який призводить до проліну в залишку 25 у сигнальній пептидній послідовності, асоціюється в європейській популяції зі зниженим ризиком гіпертонії (13). Алель 897C другого поліморфізму, який призводить до проліну в залишку 10 у сигнальній пептидній послідовності, асоціюється в азіатській популяції з підвищеним ризиком гіпертонії (14, 15), але чи впливають зміни безпосередньо на АТ і як не визначено.

Ці дослідження документують складний вплив на серцево-судинну систему, який є результатом змін у функції TGFβ1. Однак чіткої картини ефектів успадкованих варіацій, які просто змінюють базальний рівень експресії TGFβ1, не змінюється, не змінюючи амінокислотних послідовностей поліпептидів, які є результатом. Цей тип інформації має особливе значення, коли амінокислотні послідовності настільки ж збережені, як і послідовності поліпептидів TGFβ1. Таким чином, 111 із 112 залишків, що містять активний продукт TGFβ1, ідентичні у миші та людини, а великі ділянки в інших 278 залишках попередника TGFβ1 також ідентичні (16).

Відповідно, ми генерували мишей з експресією Tgfb1 ∼10%, 50%, 200% та 300% в нормі, що охоплює діапазон, ймовірно, серед загальної людської популяції. Ми виявили, що на різні параметри, які, як відомо, регулюють АТ або реагують на зміни в ньому, надзвичайно пропорційно впливають ці зміни в експресії Tgfb1, вказуючи на те, що навіть помірні спадкові зміни в експресії людського гена TGFB1 можуть мати значні серцево-судинні ефекти.

Результати

Генерація гіпо/гіперморфних мишей для TGFβ1.

Як попереднє використання генного націлювання для генерування мишей, що експресують змінені рівні TGFβ1, ми вперше використали нашу опубліковану систему (17) для порівняння відносного впливу на стабільність мРНК 3'-нетранслірованої області (UTR) Tgfb1 порівняно з панеллю інші 3′-UTR. Цей тест показав, що ми можемо отримати інформативно низький і високий рівень експресії TGFβ1, використовуючи генну націленість, щоб замінити природний 3′-UTR Tgfb1 нестабільним 3′-UTR онкогену остеосаркоми FBJ (Fos) або стабільним 3 ′ -UTR гена бичачого гормону росту (bGH) (рис. S1 A – C).

Ми прийшли до висновку, що чотири типи мишей, генеровані за допомогою нашої процедури орієнтування на гени, мають експресію мРНК Tgfb1 ∼10%, 50%, 200% та 300% в нормі, що охоплює діапазон, який, ймовірно, може траплятися в загальній популяції людей.

Хімія крові та гематологія гіпо/гіперморфних мишей TGFβ1.

Глюкоза в плазмі, інсулін у плазмі, азот сечовини в плазмі, креатинін у плазмі, натрій у плазмі, хлорид у плазмі та осмолярність плазми (таблиці S1 та S2) не відрізнялися від ВТ у всіх мишей у віці 12 тижнів, за винятком калію плазми L/L мишей було значно менше, ніж WT (4,9 ± 0,1 мЕкв/л та 5,7 ± 0,1 мЕкв/л; P для L/L проти WT −4).

Гематокрити мишей L/L, L/+, H/+ та H/H неможливо було відрізнити від WT (таблиці S1 та S2).

Адренокортикальна функція у мишей TGFβ1 Hypo/Hypermorphic.

Рівні альдостерону в плазмі крові поступово зростали, оскільки генетично контрольована експресія Tgfb1 зменшувалася, коливаючись від ∼50% нижче ВТ у мишей H/H до ∼200% ВТ у мишей L/L (рис. 2А). Рівні кортикостерону в плазмі крові (рис. 2B) були значно вищими за норму у мишей L/L (329 ± 57 та 145 ± 23 нг/мл; P для L/L проти WT † P †† P −4, ‡ P - 5 проти ВТ. (A) Рівні альдостерону в плазмі. (B) Рівні кортикостерону в плазмі. (C) Рівні мРНК для ферментів, необхідних для синтезу альдостерону в надниркових залозах. (D) Обсяг плазми. BW, маса тіла.

Адренокортикальна функція у гіпо/гіперморфних мишей TGFβ1 у віці 12 тижнів. * P † P †† P −4, ‡ P −5 проти WT. (A) Рівень альдостерону в плазмі. (B) Рівень кортикостерону в плазмі. (C) Рівні мРНК для ферментів, необхідних для синтезу альдостерону в наднирниках. (D) Об’єм плазми. BW, маса тіла.

Експресія мРНК надниркових залоз двох генів, що визначають мітохондріальні ферменти, безпосередньо беруть участь у синтезі кортикостерону та його продукту альдостерону, 11-бета-гідроксилази (Cyp11b1) та альдостерон-синтази (Cyp11b2), тісно відповідала прогресивним змінам рівня альдостерону в плазмі крові (рис. 2С). ). Інші гени, що беруть участь у стероїдогенезі, стероїдогенний гострий регуляторний білок (зірка), гідрокси-дельта-5-стероїдна дегідрогеназа, 3 бета- та стероїдна дельта-ізомераза 1 (Hsd3b1) та 21-гідроксилаза (Cyp21a1), мали підвищену експресію при експресії Tgfb1 було нижче норми, хоча лише в надниркових залозах L/L це досягло значущості (рис. 2C).

Мікроскопічне дослідження надниркових залоз не показало жодних структурних відхилень, таких як вузлова гіперплазія, у жодної з мишей (рис. S3), але вага надниркових залоз, нормалізований до маси тіла, у мишей L/L подвоївся (0,155 ± 0,014% маси тіла проти 0,082 ± 0,007% маси тіла; PL/L проти WT L/L (n = 6): 64 ± 9%, P = 0,11]. Ці спостереження свідчать про те, що найбільш вірогідним фактором, що визначає прогресивні зміни обсягу плазми, є зсув реабсорбції натрію, спричинений прогресивними змінами рівнів альдостерону в плазмі в результаті генетично обумовлених відмінностей у експресії Tgfb1.

Артеріальний тиск у гіпо/гіперморфних мишей Tgfb1.

Миші L/L мали помітно вищий систолічний артеріальний тиск (sBP), ніж WT, незалежно від того, досліджувались методом хвостової манжети (138 ± 3 мм рт. Ст. Проти 106 ± 3 мм рт. Ст.; P −5) або за допомогою телеметрії (146 ± 3 мм рт. Ст. Проти . WT 120 ± 2 мм рт.ст .; P −5); частота пульсу мишей L/L була істотно нижчою за WT за обома методами (за допомогою телеметрії 494 ± 16 уд/хв проти 661 ± 15 уд/хв; P ‡ P −5 проти WT. (B) ЧСС у п'яти генотипах мишей методом хвостової манжети. ‡ P −5. (C) Систолічний артеріальний тиск (sBP), діастолічний артеріальний тиск (dBP) та середній артеріальний тиск (MAP), вивчені за допомогою телеметрії у п’яти генотипах мишей. ‡ P −5 проти WT. (D) Частота серцевих скорочень у п’яти генотипів мишей з телеметрією. †† P −4 проти WT.

Підвищений артеріальний тиск і зниження частоти серцевих скорочень у мишей L/L у віці 12 тижнів. (А) Систолічний артеріальний тиск (sBP) у мишей L/L, L/+, WT, H/+ та H/H, визначений методом хвостової манжети. ‡ P −5 проти WT. (B) Частота серцевих скорочень у п’яти генотипів мишей методом хвостової манжети. ‡ P −5. (C) Систолічний артеріальний тиск (sBP), діастолічний артеріальний тиск (dBP) та середній артеріальний тиск (MAP), вивчені за допомогою телеметрії у п’яти генотипах мишей. ‡ P −5 проти WT. (D) Частота серцевих скорочень у п’яти генотипів мишей за допомогою телеметрії. †† P −4 проти WT.

Градуйовані зміни в системі ренін-ангіотензин в гіпо/гіперморфах TGFβ1.

У системі ренін-ангіотензин відбулися багаторазові зміни у відповідь на генетично контрольовані зміни експресії Tgfb1, і все в тому напрямку, який, як очікується, підтримував би нормальний артеріальний тиск перед аномально низькими або високими обсягами крові. Таким чином, концентрація ангіотензину II у плазмі коливалась від ~ 30% від норми у мишей L/L до ~ 200% від норми у мишей H/H у зворотній кореляції з обсягами плазми (рис. 4А). Рівні реніну в плазмі, рівні мРНК реніну 1c (Ren1c), рівні мРНК перетворюючого ферменту (Ace) ангіотензину в легенях та рівні мРНК ангіотензиногену (Agt) у печінці демонструють подібні зміни, хоча L/L та H/Миші H мали пропорційно більшу реакцію, ніж миші L/+ та H/+ (рис. 4 B та C).

Система ренін – ангіотензин – альдостерон у мишей L/L, L/+, WT, H/+ та H/H у віці 12 тижнів. * P † P †† P −4 проти WT. (А) Рівні ангіотензину II у плазмі. (B) Активна концентрація реніну в плазмі. (C) Рівні мРНК тканин для компонентів системи ренін-ангіотензин.

Оксид азоту та інші системи контролю артеріального тиску в гіпоморфах TGFβ1.

Оскільки попередні дослідження припускають, що як TGFβ1, так і альдостерон впливають на активність та/або експресію ендотеліальної оксиду азоту (NO) синтази (eNOS) (18, 19), гіпертонія у мишей L/L може бути частково зумовлена ​​зменшенням eNOS функція. Щоб оцінити цю можливість, ми виміряли вміст білка в серині1177-фосфорильованому eNOS у нирках і виявили, що він більший у мишей L/L, ніж у WT (рис. 5А), хоча тренін495-фосфорильований eNOS, загальний eNOS та мРНК eNOS рівні порівнянні між двома генотипами (рис. 5 B, C та F). Подібним чином вміст білка в серин473-фосфорильованій серин/треонін протеїнкіназі Akt (Akt) більший у мишей L/L, ніж у WT, хоча вміст загального Akt порівнянний між двома генотипами (рис. 5 D та E).

Система оксиду азоту (NO) у нирках мишей WT та L/L самців у віці 12 тижнів. * Р † P -/NO3 -) рівні (мкмоль/л).

На відміну від попередньої висновку про те, що експресія індуцибельної NOS та сироваткові рівні NO2 -/NO3 - (кінцевих продуктів метаболізму NO) помітно підвищуються у нульових мишей TGFβ1 (20), ми не виявили значущих відмінностей між WT та L/L мишей за цими параметрами (рис. 5 G та I), хоча ниркова експресія нейронального NOS значно знижується у L/L мишей (рис. 5H). З цих результатів ми дійшли висновку, що система NO навряд чи зіграє причинну роль у підвищеному артеріальному тиску у мишей L/L.

Крім того, параметри діяльності кількох інших систем, пов'язаних з контролем АТ, не відрізнялися у мишей L/L та WT, включаючи метанефрин [WT (n = 6): 47,5 ± 5,5 пг/мл проти L/L (n = 6): 38,6 ± 2,9 пг/мл, P = NS] та норметанефрин [WT (n = 6): 668 ± 87 pg/ml проти L/L (n = 6): 792 ± 89 pg/мл, P = NS], показники адренергічної активності та трийодтироніну [WT (n = 6): 0,97 ± 0,02 pg/мл проти L/L (n = 6): 0,89 ± 0,07 pg/ml, P = NS] та тироксину [WT (n = 6): 3,01 ± 0,13 пг/мл проти L/L (n = 6): 2,65 ± 0,26 пг/мл, P = NS], показники активності щитовидної залози.

Баланс води та електролітів у гіпо/гіперморфних мишей TGFβ1.

Споживання їжі, нормалізоване до маси тіла, не відрізнялося за п’ятьма генотипами (рис. 6А), але споживання води мишами L/L було майже вдвічі більшим за норму (рис. 6B). На відміну від цього, об’єм та осмолярність сечі у мишей L/L були менше однієї п’ятої норми (рис. 6 C та G). Їх добова екскреція натрію, калію та хлориду була також зменшена (рис. 6 D – F), хоча, як описано вище, їх концентрація натрію та хлориду в плазмі та осмолярність плазми були нормальними (таблиці S1 та S2).

Дані метаболічних досліджень у мишей L/L, L/+, WT, H/+ та H/H у віці 12 тижнів. BW, маса тіла. * P † P +) та електролітного балансу, незважаючи на збільшення споживання води та значні втрати води та електролітів через позаниркові механізми.

Ниркова функція у гіпо-/гіперморфних мишей TGFβ1.

Ниркова гістологія у мишей з різницею в експресії Tgfb1 не виявила значущих відмінностей від WT (рис. S7). Також швидкості клубочкової фільтрації та плазмові концентрації азоту сечовини та креатиніну не відрізнялися від ВТ (рис. S8 та таблиці S1 та S2), вказуючи на те, що функція нирок у мишей є нормальною у віці 12 тижнів, коли загальні ефекти різних рівнів Tgfb1 вже повністю розроблений.

Рівні мРНК нирок у L/L мишей генів, пов’язаних з трубчастим транспортом води та натрію, не відрізнялися від WT (рис. S9). Однак, на відміну від цієї відсутності відмінностей у експресії мРНК генів, що кодують α, β та γ субодиниці Na + -K + АТФази (NK; рис. S9), активність NK у гомогенатах нирок виявилася бути помітно збільшеним у мишей L/L (у 2,7 рази більше норми для L/L проти WT; P † P †† P + -K + ATP-аза (NK), вивчена шляхом чутливого до конверсії АТФ в неорганічний фосфат. (B ) Ser фосфорилювання NKα1. (C) Ряс білка NKα1. (D) Загальна активність ENaC у мишей WT та L/L, оброблених носієм (Veh), спіронолактоном (Spi; 50 мг/кг/добу протягом 7 днів) та DOCA (120 мг/кг/день протягом 3 днів). (E) ENaC відкрита ймовірність (Po). (F) Функціональний вираз ENaC (fN).

Функція нирок у гіпоморфних мишей TGFβ1. * P † P †† P + -K + АТФаза (NK), вивчена за допомогою чутливого до уабаїну перетворення АТФ в неорганічний фосфат. (B) Ser фосфорилювання NKα1. (C) Достаток білка NKα1. (D) Загальна активність ENaC у мишей WT та L/L, оброблених носієм (Veh), спіронолактоном (Spi; 50 мг/кг/день протягом 7 днів) та DOCA (120 мг/кг/день протягом 3 днів). (E) ENaC відкрита ймовірність (Po). (F) Функціональний вираз ENaC (fN).

Подібним чином, хоча експресія мРНК у мишей L/L генів Scnna, Scnnb та Scnng не відрізнялася від WT, загальна активність епітеліального натрієвого каналу (ENaC) виявилася помітно більшою (2,0 рази WT) в L/L, ніж у мишей WT через підвищену ймовірність відкриття ENaC (в 1,5 рази WT) та функціональну експресію ENaC (в 1,6 рази WT). Системне підвищення мінералокортикоїдів за допомогою ін’єкції дезоксикортикостерону ацетату (DOCA) збільшувало активність ENaC в 1,9 рази за WT, але не мало подальшого стимулюючого ефекту у мишей L/L, вказуючи на те, що їх ENaC був майже максимально активованим (рис. 7 G – J).

Ми прийшли до висновку, що, хоча кількість білків NK і ENaC та відповідних мРНК у мишей L/L не збільшується, канальцева реабсорбція натрію збільшується за рахунок наднормативної активації білків.

Фармакологічна нормалізація гіпертонії гіпоморфів Tgfb1 10%.

Фармакологічні тести показали, що спіронолактон (антагоніст мінералокортикоїдних рецепторів) на рівнях, які суттєво не змінювали АТ мишей WT, знижував АТ і об’єм плазми та збільшував натрій у сечі у мишей L/L до рівнів, які не відрізняються від ВТ (рис. . 8 A – C, таблиця S3); це також зменшило загальну активність ENaC як у мишей L/L, так і у WT до ~ 35% необробленої WT і скасувало різницю в активності ENaC між L/L і WT (рис. 7D). Амілорид (інгібітор ENaC) також нормалізував АТ, об’єм плазми та натрій у сечі у мишей L/L (рис. 8 A – D). На противагу цьому, аліскірен (інгібітор реніну), лозартан (антагоніст рецептора ангіотензину II типу 1), при застосуванні в дозах, які значно знижували sBP WT, не нормалізували АТ мишей L/L (рис. 8А) . Фуросемід (петльовий діуретик) знижував sBP мишей L/L та WT незалежно від генотипу, тоді як метиловий ефір N ω-нітро-L-аргініну (НАЗВАННЯ; інгібітор NOS) збільшував їх sBP, також незалежно від генотипу. (Рис. 8А, таблиця S3).

Фармакологічна нормалізація гіпертонії 10% гіпоморфів Tgfb1. (A) Систолічний артеріальний тиск (sBP) методом хвостових манжет у 12-тижневих WT (білі колонки) та L/L (чорні колонки) мишам, яким вводили транспортний засіб (Veh), аліскірен (Алі; 40 мг/кг/d ip), лозартан (Los; 10 мг/кг/d ip), спіронолактон (Spi; 50 мг/кг/d ip), амілорид (Ami; ​​3 мг/кг/d ip), фуросемід (хутро; 40 мг/кг/д ip), або N ω-нітро- L-аргінін метиловий ефір (НАЗВА; 30 мг/кг/д ip) протягом 2 тижнів. * P † P †† P −4 порівняно з групою того самого генотипу, яка отримувала носій. NS, суттєвої різниці немає. (B) Об’єм плазми у мишей WT та L/L без і зі спіронолактоном або амілоридом. (C) Виведення натрію з сечею. BW, маса тіла. † Миші PH/+ і Tgfb1 H/H) генерувались на генетичному тлі C57BL/6 шляхом отримання потомства від мишей-самців Tgfb1 L/+, що мають повсюдно експресований трансгеном Cre рекомбінази, що індукується тамоксифеном, (інжектований тамоксифен лабораторії Джексона) (50 mg⋅kg −1 ⋅d −1 ip в кунжутній олії протягом 5 днів). Ефекти спіронолактону (50 мг⋅кг −1 ⋅d −1 в/в протягом 4 тижнів) та амілориду (3 мг⋅кг −1 ⋅д −1 в/в протягом 4 тижнів) у 12-тижневих мишей Tgfb1 L/L були також вчився.

Наші експерименти були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Північної Кароліни.

Подяка

Цю роботу підтримали Національні інститути грантів HL49277, HL70523, HL71266, DK20593, DK59637, DK056350 та DK34987; грант Американської асоціації серця (SDG2230391); грант Шведського фонду серця і легенів; грант Шведської дослідницької ради (32X-10860); та нагороду за розвиток кар'єри (2-2006-108) від Фонду досліджень діабету серед неповнолітніх.

Виноски

  • ↵ 1 Кому слід адресувати листування. Електронна пошта: mkakokimed.unc.edu або oliver_smithiesmed.unc.edu .