Пептидне гідрування та інкапсуляція клітин для тривимірної культури клітин раку молочної залози MCF-7

Співпрацювали в цій роботі з: Хончжоу Хуан, Ін Дін

Афілійований відділ зернової науки та промисловості, Університет штату Канзас, Манхеттен, штат Канзас, Сполучені Штати Америки

Співпрацювали з цією роботою з: Хончжоу Хуан, Ін Дін

Афілійований відділ біохімії Канзаського державного університету, Манхеттен, штат Канзас, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ діагностичної медицини/патобіології, Університет штату Канзас, Манхеттен, штат Канзас, Сполучені Штати Америки

Хунчжоу Хуан,
Ін Дін,
Сюжи С. Сонце,
Чт А. Нгуєн

Цифри

Анотація

Цитування: Huang H, Ding Y, Sun XS, Nguyen TA (2013) Пептидне гідрування та інкапсуляція клітин для тривимірної культури клітин раку молочної залози MCF-7. PLoS ONE 8 (3): e59482. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059482

Редактор: Адам Дж. Енглер, Каліфорнійський університет, Сан-Дієго, Сполучені Штати Америки

Отримано: 17 вересня 2012 р .; Прийнято: 14 лютого 2013 р .; Опубліковано: 20 квітня 2013 р

Фінансування: Цей проект був частково профінансований Програмою цільової досконалості KSU та Стипендіальною програмою KSU, а також внеском (№ 12-181-J) від Канзаської сільськогосподарської експериментальної станції. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Двовимірні (2D) субстрати, такі як полістирол культури тканин та поверхня тканинних аналогів, вносять величезний внесок у сучасні дослідження клітин in vitro; однак традиційні 2D-платформи не можуть точно імітувати складну 3D-архітектуру позаклітинного матриксу (ECM), де перебувають природні клітини [1] - [4]. У 2D-культурі одношарові клітини відчувають однорідну концентрацію поживних речовин та факторів росту, які індукують неприродне середовище клітин та взаємодії клітин-клітин, даючи плоску та розтягнуту морфологію [5]. Недавні дослідження показали, що морфологічні відмінності клітин, культивованих у 2D та 3D, можуть демонструвати кілька разючих відмінностей у тонких клітинних процесах, таких як проліферація, апоптоз, диференціація, експресія генів, міграція та чутливість до наркотиків [6] - [9]. З іншого боку, біологічні 3D-системи in vivo, такі як тваринні моделі, є дорогими та трудомісткими. Тому необхідні вдосконалені системи 3D-моделей in vitro, щоб заповнити пробіл між неточними 2D-системами та моделями тварин, імітуючи складність ECM та фізіологічну значимість біологічної системи in vivo.

У цьому дослідженні розчин нещодавно ідентифікованого пептиду, званий h9e, готували при нейтральному pH і змішували з мінімальним ефірним середовищем (MEM, з 10% FBS) при кімнатній температурі. Після змішування пептиди h9e самостійно збираються в гідрогелеву матрицю з кінцевою концентрацією пептиду до 1 мМ (0,17%). Без введення будь-якого додаткового гелеутворювального буфера або регулювання рН середовища або температури, пептид забезпечує зручний і м’який процес утворення гідрогелю і дозволяє оточувати клітини своїм культуральним середовищем під час інкапсуляції клітин (таблиця S1). Що ще цікавіше, механічна міцність цієї гідрогелевої матриці демонструє особливу здатність до деформації та повторного збирання, що дозволяє гелерозчинній трансформації шляхом багаторазового піпетування. Клітинна лінія раку молочної залози MCF-7 була обрана як модель для вирощування в 3D культурі гідрогелів h9e-MEM. Дослідження морфології клітин, життєздатності та проліферації показали, що клітини виявляли 3D-цитоархітектуру в гідрогелевій матриці та зберігали високу біоактивність для подальших досліджень після виділення. Цисплатин, протираковий препарат, використовували для вивчення його ефективності на клітинах MCF-7 у матриці гідрогелю. Загалом, результати показують сильну підтримку того, що пептид h9e є перспективним 3D-матеріалом культури клітин для тестування на наркотики.

Матеріали і методи

Матеріали

N, N-диметилформамід (DMF), трифтороцтова кислота (TFA), піперидин, N, N-диізопропілетиламін (DIEA), триізопропілсилан (TIS), параформальдегід, глутаральдегід, цис-Діаміндіхлор-платина, 0,4% трипановий блакитний інсулін, 0,4% трипановий синій інсулін, -актинові антитіла були придбані у Sigma-Aldrich (Мілуокі, Вісконсин). N-метилпірролідінон (NMP), безводний ефір, дихлорметан (DCM) та бікарбонат натрію були придбані у Fisher Scientific (Пітсбург, Пенсільванія). Rink Amide MBHA Смола, 2- (1H-бензотріазол-1-іл) -1,1,3,3-тетраметилуроній гексафторфосфат (HBTU) та всі захищені амінокислоти були придбані у EMD Biosciences (Сан-Дієго, Каліфорнія). N-гідроксибензотріазол (HOBT) був придбаний у CEM (Matthews, NC). Піруват натрію, незамінні амінокислоти, MEM із солями Орла, розчин трипсину TrypLE Express, 4 ′, 6-діамідино-2-феніліндол (DAPI) та флуоресцентний барвник Hoechst 33342 (10 мг/мл) придбані у Invitrogen (Carlsbad, Каліфорнія). Фетальна бичача сироватка (FBS) була придбана у Atlanta Biologicals (Лоуренсвілль, Каліфорнія). Анти-сурвівін, анти-Ki67 та анти-каспаза-3 антитіла були отримані від Santa Cruz Biotechnologies (Санта-Крус, Каліфорнія). Антирозщеплені каспазу-3 та зв’язані з HRP антитіла проти кролика/миші були придбані у Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Культура клітин

Клітинна лінія раку молочної залози людини MCF-7 була придбана у American Type Cell Culture (ATCC) (Манассас, Массачусетс). Клітини вирощували в середовищі MEM з 10% (об/об) FBS, 1 мМ пірувату натрію, 17,9 мМ бікарбонату натрію, 0,01 мг/мл інсуліну та 1% (об/об) несуттєвої амінокислоти. Клітини витримували в колбах культури тканин Т-75 см 2 (Greiner Bio-one, Begium) при 37 ° C з 5% (об/об) CO2. Клітини регулярно пропускали трипсином, а середовище змінювали через день.

Синтез і гідрогеляція пептидів

Пептид h9e синтезували згідно з раніше опублікованим протоколом [36]. Коротко кажучи, пептиди були синтезовані на автоматизованому синтезаторі мікрохвильових пептидів CEM Liberty (CEM Corporation, Matthews, NC) відповідно до нестабільної 9-флуоренілметоксикарбонільної (Fmoc) стратегії з амідною смолою Rink та захищеними Fmoc амінокислотами. Після остаточного зняття захисту з N-кінцевої групи Fmoc зв’язані зі смолою пептиди зняли з бічного ланцюга та розщепили, використовуючи TFA/TIS/воду (95/2,5/2,5 об./Об.). Пептиди осаджували і тричі промивали безводним ефіром, розчиняли в ацетонітрилі та деіонізованій воді (50/50 об./Об.), Потім сушили ліофілізацією. Молекулярна маса та чистота синтезованих пептидів були підтверджені за допомогою матричної лазерної десорбції/іонізації за часом масової спектроскопії та високоефективної рідинної хроматографії.

Ліофілізований пептид додавали до 100 мМ бікарбонату натрію і повністю розчиняли при магнітному перемішуванні протягом 3 годин з кінцевою концентрацією пептиду 10 мМ. Для гідрогеляції розчин пептиду додавали в MEM з 10% FBS і суміш струшували вручну протягом 10 секунд. Пептидний гідрогель утворюється протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з кінцевою концентрацією пептиду 1, 2 та 3 мМ.

Реологічні випробування

Культивування клітин у гідрогелі h9e

Розчин h9e стерилізували ультрафіолетовим опроміненням (254 нм) протягом 30 хвилин до інкапсуляції клітин. Клітини MCF-7 відокремлювали від колби за допомогою трипсину і гранулювали центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 5 хвилин. Надосадову рідину видаляли і гранульовані клітини ресуспендували в MEM. Кількість клітин підраховували за допомогою целометра Auto 2000 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). MEM, що містить клітини MCF-7, ретельно змішували з розчином пептиду h9e і суміш висівали в кожну лунку 12-лункової культуральної пластини (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ). Культурну пластинку поміщали в інкубатор при 37 ° C (Thermo Scientific, Asheville, NC) приблизно на 30 хвилин. Після повного гідрування 1 мл МЕМ обережно додавали до верхньої частини гідрогелю, щоб запобігти висиханню під час тривалої інкубації. Середовище на вершині гідрогелю змінювали кожні 2 дні.

Виділення клітин з гідрогелю h9e

Для виділення клітин з матриксу гідрогелю до кожної культури клітин гідрогелю в 12-лунковому планшеті додавали 2 мл MEM. Гідрогель із вбудованими клітинами ретельно змішували з MEM за допомогою піпетки і переносили в пробірку для центрифуги. Додавали додаткові 4 мл MEM, щоб добре промити культуру клітин і зібрати в пробірку для центрифуги. До лунки додавали один мл розчину трипсину, що дозволяло клітинам відокремлюватися від лунки. Планшет інкубували при 37 ° С протягом 5 хвилин і розчин знову збирали в пробірку для центрифуги. Пробірку для центрифуги поміщали на лід. Ще 6 мл MEM додавали до пробірки для центрифуги для кінцевого об'єму 15 мл. Розчин ретельно перемішували і клітини гранулювали центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 5 хвилин при 4 ° С. Надосадову рідину видаляли і осад клітин збирали.

Аналіз розподілу клітин

Клітини MCF-7 (1 × 10 6 клітин/лунка) культивували в 3 мМ h9e/MEM гідрогелі протягом 5 днів. Кластер клітин виділяли з гелевого матриксу та повторно суспендували у 2 мл MEM. Десять мкл (10 мг/мл) флуоресцентного барвника Hoechst 33342 додавали для фарбування клітинних ядер. Клітинний розчин інкубували при 37 ° С протягом 30 хвилин. Помічені клітини промивали 3 рази середовищем MEM і повторно капсулювали в межах 3 мМ гідрогелевої матриці h9e/MEM. Конструкції клітин/гелів спостерігали на конфокальному мікроскопі LSM 700 (Zeiss, Jena, Німеччина).

Скануюча електронна мікроскопія (SEM)

Мережа нановолокна з гідрогелевих лісів, а також поверхневі ознаки 3D-культивованих клітин спостерігали під СЕМ. Зразки гідрогелю зневоднювали зі збільшенням концентрації етанолу від 50% (об/об) до 100% (об/об) при 5% за крок і 15 хвилин для кожного етапу. Потім етанол видаляли сушаркою з критичною точкою (Samdri-790B, Tousimis Research Corp., Rockville, MD). Зразки гідрогелю з клітинами фіксували у суміші 2% параформальдегіду та 2% глутаральдегіду протягом 30 хвилин перед зневодненням та сушкою критичної точки. Потім зразки покривали розпиленням (бюро розпилення/травлення Desk II, Denton Vaccum, Moorestown, NJ) 3 рази (12 секунд щоразу) зі 100% Pt. Спостереження SEM проводили за допомогою FEI, Nova NanoSEM 430 (Hillsboro, ON) при 5 кВ та через детектор лінз.

Клітинна морфологія

Клітини MCF-7 (2,8 × 10 5 клітин/лунка) культивували в 2D моношарах або 3D-гідрогелях (1, 2 і 3 мМ h9e/MEM гідрогель) протягом 1, 3, 5 та 7 днів. Морфологічні характеристики клітин визначали за допомогою інвертованого світлового мікроскопа (Nikon Eclipse TE2000-u, Канагава, Японія) в дні 1, 3, 5 та 7.

Життєздатність клітин та розмноження клітин

Клітини MCF-7 (2,8 × 10 5 клітин/лунка) культивували в 2D моношарах або 3D-гідрогелях (1, 2 і 3 мМ h9e/гідрогель MEM). Клітини в 2D-культурі збирали, а клітини в 3D-культурі виділяли на дні 1, 3, 5 і 7. Суспензію клітин змішували з 0,4% трипановим синім барвником при співвідношенні 1∶1 (v/v). Життєздатність клітин та кількість життєздатних клітин досліджували Cellometer Auto 2000 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA).

Лікування клітин наркотиками

Клітини MCF-7 (0,5 × 106 клітин/лунка) культивували в 3 мМ h9e/MEM гідрогелі протягом 5 днів. Після 5-денної інкубації клітинні сфероїди виділяли і обробляли 40 мкМ цисплатину трьома методами: верхня поверхня, зверху знизу трансульва та попередньо змішували із середовищем та пептидом. Для методу верхньої поверхні ізольовані клітинні сфероїди повторно капсулювали в 3 мМ гідрогелеву матрицю h9e/MEM і культивували в 12-лункових планшетах. По одному мл середовища MEM, що містить 40 мкМ цисплатину, поміщали поверх гідрогелю в кожну лунку. Для методу трансульви ізольовані клітинні кластери повторно капсулювали в 3 мМ гідрогелеву матрицю h9e/MEM і культивували на вставці для трансавельної клітини. Середовище MEM, що містить 40 мкМ цисплатину, поміщали у верхню та нижню камери. Для попередньо змішаного методу ізольовані кластери клітин ресуспендували в середовищі MEM, що містить 3 мМ пептиду h9e та 40 мкМ цисплатину. Суміш додавали в 12-лункові планшети (1 мл суміші/лунку) для гідрогелювання. Один мл МЕМ обережно додавали у верхню частину гідрогелю, щоб запобігти висиханню під час тривалої інкубації. Засіб змінювали кожні 2 дні у всіх методах. Життєздатність клітин досліджували на 0, 1, 3, 5 та 10 дні за допомогою методу висічення трипанового синього.

Імунофлуоресценція та конфокальна мікроскопія

Вестерн-блот-аналіз

Клітини MCF-7, культивовані в 2D моношарі та 3D-гідрогелі, обробляли цисплатином. Клітини, вирощені в 2D, трипсинізували і гранулювали центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 5 хвилин. Клітини, вирощені в 3D-гідрогелях, виділяли, як описано вище. Після промивання PBS клітини інкубували в буфері для лізису (Cell Signaling Technology, Danver, MA) протягом 5 хвилин. Клітинні лізати обробляли ультразвуком з використанням соноратора Vibra-Cell (Sonics & Materials Inc, Danbury, CT), а потім центрифугували при 13000 об/хв протягом 30 хвилин при 4 ° C. Після центрифугування супернатанти збирали у вигляді цільноклітинних екстрактів. Тридцять мкг зразків розділяли градієнтом 4–20% SDS-PAGE протягом 35 хвилин при 200 В і переносили на нітроцелюлозні мембрани (Midwest Scientific, Сент-Луїс, Міссурі). Мембрани блокували 5% молоком протягом 30 хвилин і імуноблотували проти цікавого білка. Імунореакції з використанням хемілюмінесценції візуалізували за допомогою FluorChem E Imaging Instrument (ProteinSimple, Санта-Клара, Каліфорнія). Інтенсивність смуг була оцифрована за допомогою програмного забезпечення Un-Scan-It.

Статистичний аналіз

Двовибірковий t-тест використовували для аналізу різниці між різними методами лікування. Значення Р менше 0,05 вважали статистично значущим.

Результати і обговорення

Пептидне гідрування в MEM

Для ініціювання утворення гелю 100 мкл 10 мМ розчину пептиду h9e (pH 7–8) додавали до 900 мкл середовища MEM, утворюючи 1 мл суміші з концентрацією пептиду 1 мМ (0,17% мас./Об.) (Малюнок 1А). Морфологія нанорозмірної матриці гідрогелю представлена на зображенні SEM (рис. 1А). Гідрогеляція пептидів, індукована безпосередньо змішуванням розчину пептиду нейтрального рН з MEM, не тільки дозволяє уникнути складних процесів хімічного зшивання гелю, але також використовує середовище, яке зазвичай використовується в біологічних та медичних дослідженнях, забезпечуючи фізіологічний стан інкапсуляції клітин.

A. Запропонований механізм гідрогелювання генетичного пептиду h9e, індукованого MEM (зображення SEM, що демонструє нановолоконний каркас матриці гідрогелю). B. Модуль зберігання G ′ 1, 2 та 3 мМ пептидного гідрогелю під час гідрування при 37 ° C. C. SEM-зображення 1 мМ пептидного гідрогелю. D. SEM зображення 3 мМ пептидного гідрогелю.

Пряме завантаження ліків, білків або клітин під час утворення гелю є одним із найбільш зручних та ефективних способів інкапсуляції [33], [34]. Щоб забезпечити гомогенний розподіл вбудованих молекул, пептиди повинні збиратися у вигляді нановолоконної мережі за відносно короткий період з розумною міцністю, утримуючи зважені молекули перед їх осадженням. Для визначення швидкості утворення пептидного гелю гідрогелі готували з трьома концентраціями, 1 мМ (0,17% мас./Об.), 2 мМ (0,34% мас./Об.) Та 3 мМ (0,51% мас./Об.), У MEM. Модуль зберігання розчину вимірювали при 37 ° C відразу після ретельного перемішування. На малюнку 1B показані утворення пептидного гідрогелю h9e зі стабільними модулями зберігання близько 100, 400 та 700 Па відповідно. Швидкість утворення гелю зростає із збільшенням концентрації пептидів (вставка на малюнку 1B), і всі три гідрогелі досягають самонесучої міцності (близької або вище 100 Па) протягом 15 хвилин. Зображення SEM (малюнок 1C, D) вказують на те, що архітектура гідрогелю побудована шляхом переплутування нановолокон шириною 20 нм; однак гідрогель з нижчою концентрацією (1 мМ, малюнок 1С) демонструє відносно більш пухку матричну структуру порівняно з компактною структурою гідрогелю з більшою концентрацією (3 мМ, рисунок 1D). Це візуальне підтвердження додатково підтверджує різницю в міцності гідрогелів різної концентрації.

Динамічне реологічне дослідження гідрогелю h9e

Деформативність та здатність до повторного збирання гідрогелю h9e, індукованого MEM, оцінювали за допомогою динамічного реологічного тесту. Пептидні гідрогелі з 1-3 мМ зберігали при кімнатній температурі протягом ночі, потім переносили в вимірювальну систему і стабілізували протягом 10 хвилин. Шляхом розрідження при зсуві при 500% деформації протягом 1 хвилини всі три гідрогелі переходили в рідкий стан, демонструючи G ′ нижче 0,2 Па (рис. 2А). Після припинення витончення зсуву параметри приладу скидали через 1 хвилину очікування, а відновлення гідрогелю контролювали за допомогою 1% деформації зсуву протягом 1 години. Дані на малюнку 2А G 'відновлення гідрогелю протягом цього 1-годинного випробування.

A. Модуль зберігання G ′ випробування на зсув і випробування на відновлення 1, 2 та 3 мМ пептидного гідрогелю. B. Чотирикратний амплітудний розгортковий тест з деформацією на зсув від 1% до 500% та 1- 5-, 10-хвилинними перервами. C. Багаторазова доставка пептидного гідрогелю піпеткою; гідрогель розріджувався зсувом, але швидко збирався, не руйнуючи назавжди архітектуру гідрогелю. D. Випробування температурного профілю 1, 2 та 3 мМ пептидного гідрогелю від 4 ° C до 50 ° C.

Для біологічних досліджень для багатьох стандартних оперативних процедур in vitro зазвичай застосовують температури від 4 ° C до 37 ° C; тому реакція гідрогелевих матеріалів на перепади температур має великий вплив на їх практичне застосування. Для вирішення цієї проблеми було проведено реологічне тестування температурного профілю. Температуру регулювали від 4 ° C до 50 ° C для двох випробувальних кіл. На малюнку 2D показано, що G ′ гідрогелів рухається разом із температурою і виконує в 2-3 рази вище при 50 ° C, ніж при 4 ° C. Ця теплова реакція є оборотною відповідно до кіл нагрівання та охолодження гідрогелю (рис. 2D). Результати дають докази використання пептидного гідрогелю h9e як тривимірної культури клітин. Гідрогелевий матрикс зміцнюється для інкапсуляції клітин, коли він залишається при 37 ° C, але послаблюється при 4 ° C для ізоляції клітин, використовуючи стандартний метод центрифуги.