Патогенність SARS-CoV-2 у трансгенних мишей hACE2

Предмети

Анотація

Тяжкий гострий респіраторний синдром коронавірусу 2 (SARS-CoV-2) є причиною коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19), яка стала надзвичайною ситуацією в галузі охорони здоров'я, що викликає міжнародне занепокоєння 1. Ангіотензин-перетворюючий фермент 2 (ACE2) є рецептором клітинного входу для важкого гострого респіраторного синдрому коронавірусу (SARS-CoV) 2. Тут ми заразили трансгенних мишей, які експресують людський ACE2 (далі - миші hACE2), SARS-CoV-2 та вивчали патогенність вірусу. Ми спостерігали втрату ваги, а також реплікацію вірусу в легенях мишей hACE2, інфікованих SARS-CoV-2. Типовою гістопатологією була інтерстиціальна пневмонія з інфільтрацією значної кількості макрофагів та лімфоцитів у альвеолярний інтерстицій та накопиченням макрофагів у альвеолярних порожнинах. Ми спостерігали вірусні антигени в епітеліальних клітинах бронхів, макрофагах та альвеолярному епітелії. Ці явища не були виявлені у мишей дикого типу, інфікованих SARS-CoV-2. Слід зазначити, що ми підтвердили патогенність SARS-CoV-2 у мишей hACE2. Ця модель миші зараження ГРВІ-CoV-2 буде цінна для оцінки противірусних терапевтичних засобів та вакцин, а також для розуміння патогенезу COVID-19.

Наприкінці грудня 2019 року випадки COVID-19, який викликається ГРВІ-CoV-2, були виявлені та повідомлені з міста Ухань (провінція Хубей, Китай), де вони були пов'язані з ринком морепродуктів, на якому також продавали екзотичних тварин та спожив 1,3. З тих пір кількість підтверджених випадків зросла: станом на 25 лютого 2020 року в Китаї було зареєстровано майже 78 000 випадків та понад 2700 смертей, а в ряді інших країн зареєстровано випадки імпорту від мандрівників з материкового Китаю. Важливо встановити патогенність та біологію вірусу для профілактики та лікування захворювання.

Оскільки SARS-CoV-2 є дуже гомологічним SARS-CoV, людський ACE2, який є рецептором входу SARS-CoV, також вважається високомолекулярною здатністю до SARS-CoV-2 шляхом молекулярно-біологічного аналізу 2,5 . Тому ми використовували трансгенних мишей hACE2 та мишей дикого типу, інфікованих штамом HB-01 SARS-CoV-2, для вивчення патогенності вірусу.

Чоловічий та жіночий дикий тип без специфічних патогенів (n = 15) або hACE2 (n = 19) мишей віком 6–11 місяців інокулювали інтраназально штамом SARS-CoV-2 HB-01 у дозі 10 5 50% інфекційної дози культури тканин (TCID50) на 50 мкл об’єму посівного матеріалу на мишу після мишей інтраперитонеально знеболювали за допомогою 2,5% авертину; підроблені миші hACE2 (n = 15) використовувались як контроль. Клінічні прояви реєстрували у 13 мишей (3 мишей дикого типу, інфікованих HB-01; 3 мишей, підданих імітації hACE2; та 7 мишей, інфікованих HBACE 01). Протягом 14 днів спостереження ми спостерігали незначну щетину і втрату ваги лише у мишей hACE2, інфікованих HB-01, а не у заражених HB-01 мишей дикого типу чи мишей, оброблених імітацією hACE2; інших клінічних симптомів, таких як вигин спини та зниження реакції зовнішніх подразників, не було виявлено ні у однієї з мишей. Примітно, що втрата ваги мишей, інфікованих HB-01, hACE2, становила до 8% через 5 днів після зараження (dpi) (рис. 1а).

Крім того, ми продемонстрували колокалізацію білка SARS-CoV-2 S (рис. 3f) та людського рецептора ACE2 (рис. 3g) в альвеолярних епітеліальних клітинах інфікованих HB-01 мишей hACE2 за допомогою імунофлюоресценції при 3 dpi (рис. . 3 год). Це явище не було виявлено у підроблених мишей hACE2 (рис. 3a – d) або заражених HB-01 мишей дикого типу (дані не наведені), що вказує на те, що SARS-CoV-2 - як і SARS-CoV - використовує АСЕ2 людини як рецептор для входу 5 .

Колокалізація білка SARS-CoV-2 S та рецептора ACE2 людини в легенях мишей hACE2. Зрізи інкубували з антитілом проти SARS-CoV-2 S, антитілом до людини ACE2 та DAPI. a-d, Легеневі зрізи підроблених мишей hACE2. e-h, Легеневі зрізи мишей, заражених HB-01, HB-01. Білі стрілки показують вірусний білок S (f) та АСЕ2 людини (g); жовті стрілки показують злиття вірусного білка S та АСЕ2 людини (h). Шкали шкали, 25 мкм. Дані в a-h є представниками трьох незалежних експериментів.

Швидкість географічного розповсюдження COVID-19 призвела до того, що хвороба була оголошена надзвичайною ситуацією в галузі охорони здоров'я, що викликає міжнародне занепокоєння, а випадки захворювання повідомлялися на кількох континентах лише за кілька тижнів після першого повідомлення про захворювання 6. Хоча біоінформатикою було встановлено, що збудником цієї епідемії є новий коронавірус, необхідно, щоб це було підтверджено експериментами на тваринах (слідуючи постулатам Коха) 7. Попередні клінічні дослідження підтвердили ізоляцію вірусу від господарів із захворюванням та культивування в клітинах хазяїна 1. Тут ми показуємо, що після експериментального зараження мишей hACE2 одним із найдавніших відомих ізолятів SARS-CoV-2, наша миша модель зараження SARS-CoV-2 демонструє вірусну реплікацію в легенях, що характеризується помірною інтерстиціальною пневмонією - подібною до початкові клінічні повідомлення про пневмонію, спричинену ГРВІ-CoV-2 8. Більше того, ми також спостерігали специфічні антитіла проти SARS-CoV-2 та повторно виділяли вірус із заражених мишей.

Рівень смертності, про який зараз повідомляється про випадки COVID-19, становить близько 2%, що означає, що - до цих пір - SARS-CoV-2, здається, не спричиняє високих показників летальності серед SARS-CoV (9–11%) 9; це свідчить про те, що між двома вірусами існують відмінності в патогенності. У мишей патогенність SARS-CoV-2 видається незначною порівняно з SARS-CoV; остання викликає позалегеневі пошкодження органів (включаючи мозок, нирки, кишечник, серце та печінку), і, крім того, нейрони сприйнятливі до зараження SARS-CoV - церебральний васкуліт та крововилив спостерігали у інфікованих SARS-CoV мишей hACE2 10,11 . Однак у мишей, інфікованих HACE2, інфікованих SARS-CoV-2, спостерігалася лише інтерстиціальна пневмонія, що свідчить про різницю в патогенності між двома коронавірусами.

Наші результати демонструють патогенність SARS-CoV-2 у мишей, яка - разом із попередніми клінічними дослідженнями 1 - повністю задовольняє постулати Коха 7 і підтверджує, що SARS-CoV-2 є збудником, відповідальним за COVID-19. Наша миша модель зараження ГРВІ-CoV-2 буде цінна для оцінки противірусних терапевтичних засобів та вакцин, а також для розуміння патогенезу цієї хвороби.Примітка, додана в доказ: У версії цієї статті, яка була спочатку опублікована в Інтернеті, на рис. 2а міститься копіювання. У версії малюнка, яка була опублікована спочатку, замість зрізів тканин з макета ACE2 + були показані зрізи тканин зразка WT + HB-01. Оригінально опублікований малюнок можна знайти тут як додатковий рис. 1.

Методи

Для попереднього визначення обсягу вибірки не використовувались статистичні методи. Експерименти не були рандомізовані, і слідчі не були сліпими для розподілу під час експериментів та оцінки результатів.

Заява про етику

Дослідження на мишах проводили в установці рівня біобезпеки тварин 3 (ABSL3) з використанням ізоляторів, фільтрованих HEPA. Усі процедури у цьому дослідженні з участю мишей були розглянуті та схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Інституту лабораторних наук про тварин, Медичний коледж Пекінського союзу (BLL20001). Усі експерименти відповідали всім відповідним етичним нормам.

Віруси та клітини

Штам SARS-CoV-2 HB-01 був наданий W. Tan 1. Повний геном для цього SARS-CoV-2 був поданий до GISAID (ідентифікатор: BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020 | EPI_ISL_402119) та депонований у Китайському національному центрі мікробіологічних даних (номер приєднання NMDC10013001 та номер приєднання генома) MDC60013002-01). Насіння SARS-CoV-2 та дослідження ізоляції вірусу проводили в клітинах Vero, які підтримувались у модифікованому середовищем Орла (DMEM) Дульбекко (Invitrogen), доповненому 10% плодовою бичачою сироваткою (FBS), 100 МО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину та інкубують при 37 ° С, 5% СО2. Для інфікованих мишей гомогенати легенів використовували для тестів на титрування вірусів із використанням кінцевого титрування в клітинах Vero E6. Титри вірусів супернатанту визначали за допомогою стандартного аналізу TCID50.

Миші експерименти

Для експериментів на мишах від Інституту лабораторних наук про тварин Медколеджу Пекінського союзу були отримані миші чоловічої та жіночої статі hACE2 без специфічних патогенів 6–11 місяців. Трансгенних мишей генерували мікроін’єкцією миші Туз2 промоутер, керуючий людиною ACE2 послідовність кодування в пронуклеї запліднених яйцеклітин від мишей ICR, а потім інтегрований АСЕ2 людини був ідентифікований за допомогою ПЛР, як описано раніше 10; АСЕ2 людини переважно експресується в легенях, серці, нирках і кишечнику трансгенних мишей. Після інтраперитонеального знеболення 2,5% авертином з 0,02 мл/г маси тіла мишей hACE2 або дикого типу (ICR) інтраназально інкубували основним вірусом SARS-CoV-2 у дозі 10 5 TCID50, а мишам hACE2 інтраназально інокулювали з рівним об'ємом PBS використовували як фальшивий контроль інфекції. За інфікованими мишами постійно спостерігали масу тіла, клінічні симптоми, реакції на зовнішні подразники та смерть. Мишей розтинали з частотою 1, 3, 5 і 7 точок на дюйм для збору різних тканин для скринінгу реплікації вірусу та гістопатологічних змін.

Приготування супернатанту гомогенату

Гомогенати тканин (1 г/мл) готували гомогенізацією перфузійних тканин за допомогою електричного гомогенізатора протягом 2 хв 30 с в DMEM. Гомогенати центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° С. Супернатант збирали і зберігали при -80 ° C для виявлення титру вірусу та вірусного навантаження.

Вилучення РНК та RT – qPCR

Метод ІФА

Специфічний IgG проти SARS-CoV-2 від зараженого HB-01 hACE2 та мишей дикого типу визначали методом ІФА. Дев'яносто шість лункових планшетів покривали білком Spike 1 (S1) SARS-CoV-2 (0,1 мкг/100 мкл, Sino Biological, 40591-V08H), досліджувані сироватки розбавляли при 1: 100 і додавали до кожної лунку, і для кожного зразка встановили 3 багаторазові лунки, а потім інкубували при 37 ° С протягом 30 хв, а потім вторинні антитіла кози проти миші, кон’юговані з HRP (ZB-2305, чжуншань, розведення 1: 10000), і інкубували при кімнатна температура протягом 30 хв. Реакцію розробили підкладкою ТМБ та визначили оптичні щільності при 450 нм (ферментний маркер Metertech960 з довжиною хвилі 450 нм).

Лабораторне приготування антитіла до SARS-CoV-2 білка S1

Мишей імунізували очищеним SARS-CoV-2 S1 білком (китайсько біологічним), а спленоцити гіперімунізованих мишей зливали з клітинами мієломи. Позитивні клони були відібрані методом ІФА з використанням білка SARS-CoV-2 S1 (Розширені дані, рис. 5). Клітинний супернатант клону 7D2, який зв’язується з білком SARS-CoV-2 S1, був зібраний для імунофлюоресцентного аналізу.

Патологічне обстеження

Розтин проводили в лабораторії рівня біобезпеки тварин 3 (ABSL3). Основні органи ретельно досліджували, а потім фіксували у 10% забуференному розчині формаліну, а парафінові зрізи (товщиною 3-4 мкм) готували регулярно. Для виявлення гістопатологічних змін у всіх органах використовували гематоксилін та еозин, періодичну кислоту – Шиффа та модифіковані трихромні плями Массона. Гістопатологію легеневої тканини спостерігали за допомогою світлової мікроскопії.

Конфокальна мікроскопія

Трансмісійна електронна мікроскопія

Супернатант з клітинних культур Vero E6, який виявляв цитопатичні ефекти, збирали, інактивували 2% параформальдегідом принаймні протягом 2 год і ультрацентрифугували для осадження частинок вірусу. Збагачений супернатант негативно фарбували на покритих плівкою сітках для дослідження. Негативні пофарбовані сітки спостерігали під просвічувальною електронною мікроскопією.

Статистичний аналіз

Всі дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 8.0. Статистично значущі відмінності визначали з використанням неспарених т-тести, студентські т-тести, Welch’s т-тести або Манна – Уітні U-тести, залежно від вимог тесту. Двосторонній P значення

Наявність даних

Усі необроблені дані можна отримати у відповідних авторів за обґрунтованим запитом. Вихідні дані надаються у цій роботі.

Список літератури

Чжу, Н. та ін. Новий коронавірус від хворих на пневмонію в Китаї, 2019. Н. Енгл. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Куба, К. та ін. Вирішальна роль ангіотензинперетворювального ферменту 2 (АПФ2) у ГРВІ, спричиненій коронавірусною травмою легенів. Нат. Мед. 11, 875–879 (2005).

Рен, Л. Л. та співавт. Ідентифікація нового коронавірусу, що спричиняє важку пневмонію у людини: описове дослідження. Підборіддя Мед. J. (англ.) 133, 1015–1024 (2020).

Китайська національна комісія з питань охорони здоров’я. Оновлення про новий спалах коронавірусної пневмонії (24 січня 2020 р). http://www.nhc.gov.cn/yjb/s7860/202002/84faf71e096446fdb1ae44939ba5c528.shtml (Національна комісія охорони здоров’я Китаю, 2020).

Xu, X. та ін. Еволюція нового коронавірусу від триваючої спалаху Ухану та моделювання його спайкового білка на ризик передачі людиною. Наук. Наука про життя Китаю. 63, 457–460 (2020).

Чан, Дж. Ф. та ін. Сімейний кластер пневмонії, асоційований з новим коронавірусом 2019 року, що вказує на передачу від людини до людини: дослідження сімейного кластера. Ланцет 395, 514–523 (2020).

Ріверс, Т. М. Віруси та постулати Коха. Дж. Бактеріол. 33, 1–12 (1937).

Huang, C. та співавт. Клінічні особливості пацієнтів, інфікованих новим коронавірусом 2019 року в Ухані, Китай. Ланцет 395, 497–506 (2020).

де Віт, Е., ван Доремален, Н., Фальцарано, Д. та Мюнстер, В. Дж. SARS та MERS: нещодавнє розуміння нових коронавірусів. Нат. Преподобний Мікробіол. 14, 523–534 (2016).

Ян, X. H. та співавт. Миші, трансгенні для ангіотензинперетворюючого ферменту людини 2, забезпечують модель коронавірусної інфекції ГРВІ. Комп. Мед. 57, 450–459 (2007).

Netland, J., Meyerholz, D. K., Moore, S., Cassell, M. & Perlman, S. Тяжкий гострий респіраторний синдром коронавірусної інфекції спричинює смерть нейронів за відсутності енцефаліту у мишей, трансгенних для людини ACE2. Дж. Вірол. 82, 7264–7275 (2008).

Подяка

Ми дякуємо Г. Ф. Гао за його поради та координацію щодо цієї роботи; Х. Ден, X. Ян і Л. Чжан за надання мишей hACE2 в подарунок; та Г. Вонгу за допомогу в коректурі рукопису. Ця робота була підтримана Національним проектом досліджень та розробок Китаю (2020YFC0841100), Фондом фундаментальних досліджень для CAMS Китаю (2020HY320001), Національним ключовим проектом досліджень та розробок Китаю (2016YFD0500304), ініціативою CAMS з інноваційної медицини Китаю (2016-I2M -2-006) та Національні мегапроекти Китаю з основних інфекційних хвороб (2017ZX10304402, 2018ZX10301403).

Інформація про автора

Ці автори внесли однаковий внесок: Лінлін Бао, Вей Ден, Баой Хуан, Хонг Гао, Цзяннин Лю

Приналежності

Пекінська ключова лабораторія для тваринних моделей нових та повторних інфекційних хвороб, Інститут лабораторних наук про тварин, Китайська академія медичних наук, Пекін, Китай

Лінлін Бао, Вей Ден, Хонг Гао, Цзяннин Лю, Цянг Вей, Пін Ю, Янфен Сю, Фейфей Ці, Яджин Цю, Фенгді Лі, Ці Льв, Цзін Сюе, Шуран Гун, Мінгя Лю, Гуанпенг Ван, Шуньі Ван, Чжиці Сін, Лінна Чжао, Хайшен Ю, Сяоцзюань Чжан та Чуан Цінь

NHC Ключова лабораторія порівняльної медицини хвороб людини, Центр порівняльної медицини, Медичний коледж Пекінського союзу, Пекін, Китай

Лінлін Бао, Вей Ден, Хонг Гао, Цзяннин Лю, Цянг Вей, Пін Ю, Янфен Сю, Фейфей Ці, Яджин Цю, Фенгді Лі, Ці Лв, Цзін Сюе, Шуран Гун, Мінгя Лю, Гуанпенг Ван, Шуньі Ван, Чжиці Сон, Лінна Чжао, Хайшен Ю, Сяоцзюань Чжан та Чуан Цінь

Ключова лабораторія біобезпеки MHC, Національний інститут контролю та профілактики вірусних захворювань, Китай CDC, Пекін, Китай

Баойін Хуан, Венлінг Ван, Пейпей Лю, Лі Чжао, Фей Йе, Хуйцзуан Ван, Веймін Чжоу, На Чжу, Вей Чжень, Цзюнь Хань, Веньбо Сю, Веньцзе Тан і Гуйчжен Ву

Інститут біології патогенів, Китайська академія медичних наук, Пекін, Китай

Лілі Рен, Лі Го, Лан Чень, Конгхуй Ван, Ін Ван, Сіньмін Ван, Ян Сяо і Ці Цзінь

Інститут медичної біології Китайської академії медичних наук, Пекін, Китай

Цянмін Сонце, Хунци Лю, Фанлі Чжу, Чунься Ма, Лінгмей Янь, Менглі Ян і Сяочжун Пен

Ви також можете шукати цього автора в PubMed Google Scholar