Оксид азоту опосередковує аномальний тубулогломерулярний зворотний зв’язок у щурів, що харчуються дієтою з високим вмістом NaCl, після субтотальної нефректомії

Відділ нефрології-гіпертонії, система охорони здоров'я Сан-Дієго і Каліфорнійський університет, Медичний факультет Сан-Дієго, Ла-Холла, Каліфорнія

Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: S. C. Thomson, Div. нефрології-гіпертонії, VASDHS, 3350 La Jolla Village Dr., 9111H, Сан-Дієго, Каліфорнія 92161 (електронна пошта: [електронна пошта захищена]).

Анотація

Протоколи мікропунктури.

В експериментах, призначених для перевірки ролі NOS макули дензи в аномальному TGF, TGF тестували в деяких нефронах із використанням стандартного ATF та в інших нефронах, де був блокатор NOS, N-монометил l-аргінін (L-NMMA; 10-4 M) доданий до ATF. Таким чином, у цих експериментах було дві перфузії/колекції на нефрона.

В експериментах, призначених для перевірки ролі cTGF в аномальному TGF, реакції TGF вимірювали в кожному нефроні до і під час додавання бензамілу до перфузату. Отже, на нефрон було чотири перфузії/колекції. Це було досягнуто шляхом введення двох мікроперфузійних піпеток нижче за восковим блоком. Одна з цих піпеток містила лише ATF, а інша - ATF плюс бензаміл (10-5 М). Бензаміл є потужним блокатором ENaC (1), а посилені відповіді TGF під час мікроперфузії бензамілу - звичайний тест, який використовується для демонстрації cTGF в опублікованих звітах (5, 8, 21, 22). Після збору контрольної реакції TGF петля Генле була перфузована бензамілом, і піпетки ATF кожну встановлювали зі швидкістю 15 нл/хв протягом 3-4 хв. Під час максимальної та мінімальної стимуляції TGF піпетку бензамілу встановлювали відповідно на 15 або 8 нл/хв, а піпетку ATF регулювали, щоб надати відповідну загальну швидкість перфузії. Для мікроаналізу кожен збір трубчастої рідини переносили у скляну піпетку з постійним отвором для вимірювання пізньої проксимальної швидкості потоку (VLP). Потім зразок підраховували на радіоактивність для визначення SNGFR.

Статистика.

Статистичний аналіз проводили за допомогою ANOVA, аналіз коваріації (ANCOVA) та повторні вимірювання ANOVA, відповідно. Лікування та окремі тварини були включені як незалежні змінні в регресії. Помилка ступеня свободи полягала в кількості нефронів, меншому за модельний ступінь свободи. Це є більш суворим, ніж те, що зазвичай роблять з даними мікропунктури, тобто призначають ступінь свободи кожному нефрону та ігнорують можливий вплив неоднорідності між тваринами. У цьому випадку ANOVA підтвердила відсутність ефекту між тваринами в обох наборах експериментів, тому однаковий статистичний результат міг бути досягнутий, ігноруючи ефект тварини. Аналіз проводили за допомогою фірмового програмного забезпечення (Systat, Evanston, IL).

Вплив LNMMA на SNGFR та відповідь TGF.

Серія LNMMA включала 210 пізніх проксимальних трубчастих рідин від шести тварин STN HS та шести штучних тварин HS. Всіх тварин годували дієтою ГС з першого післяопераційного дня. Мікропункція була зроблена на післяопераційному періоді дні 8–10. Раніше інфарктовані полюси нирки були скарифіковані. Поверхня неінфарктної частини виглядала здоровою із збільшеними канальцями та хорошим тургором для полегшення мікропунктури. Гістологія на цій стадії НТН демонструє гіпертрофію канальців та гіперплазію та легкий гломерулосклероз (11).

Дані SNGFR наведені в таблиці 1 та на рис. 1. Відповіді TGF були відносно однорідними серед тварин у кожній групі (P = 0,87 за тестом ANOVA на різницю між тваринами у відповіді TGF). Під час мінімального стимулювання TGF, SNGFR не суттєво відрізнявся між STN HS та Sham HS. Під час максимального стимулу TGF, SNGFR був удвічі вищим у STN HS, ніж фіктивний HS (P

Таблиця 1. Результати SNGFR для експериментів LNMMA

Значення виражаються як середні значення ± SE. (+) та (-) стосуються максимального та мінімального стимулу TGF. Сер. - SNGFR у середній точці TGF. Реакція TGF - зміна SNGFR, коли стимул TGF зменшується з максимального до мінімуму.

* P = 0,054 для середньої реакції TGF, яка є негативною за одностороннім т-тест.

† P = 0,0007 для ефекту LNMMA в STN HS по Student's т-тест.

Рис. 1.Лінійні графіки відображають реакції тубулогломерулярного зворотного зв’язку (TGF) для окремих нефронів, коли петля Генле пронизана LNMMA або без неї. TGF (+) позначає максимальний стимул TGF. TGF (-) позначає мінімальний стимул TGF. Графіки Tukey Box показують, як відповіді TGF розподіляються в межах кожної групи. Зміна швидкості клубочкової фільтрації з одним нефроном (ΔSNGFR) є різницею у SNGFR між TGF (-) та TGF (+). Відповідь TGF аномальна, якщо ΔSNGFR

Вплив бензамілу на SNGFR та відповідь TGF.

Серія бензамілу включала 132 пізні проксимальні трубчасті колекції рідини від чотирьох тварин STN HS та чотирьох тварин Sham HS (чотири колекції на нефрон). Дані SNGFR наведені в таблиці 2 та на рис. 2. Кореляційна матриця Пірсона для чотирьох вимірювань SNGFR у кожному нефроні показана в таблиці 3. Ефекти бензамілу на SNGFR не відрізнялися у тварин (P = 0,99 і P = 0,97 для неоднорідності між тваринами в STN HS або Sham HS). Чотири колекції на нефрон у цих експериментах включали відповіді TGF до і під час бензамілу в кожному нефроні, щоб оптимізувати статистичну потужність для виявлення ефектів бензамілу шляхом сполучення. Двосторонній ANOVA з дизайном для повторних заходів був проведений для тестування на вплив на TGF-відповідь STN HS проти Sham HS (частина суб'єкта ANOVA) та на ефекти бензамілу (частина ANOVA у суб'єктів). Ефект STN HS між суб'єктами підтвердив, що TGF був придушений або парадоксальний при STN HS щодо Sham HS (P = 0,002). Щодо частини ANOVA у суб’єктів, не спостерігалося значного впливу бензамілу на загальну відповідь TGF (P = 0,3) і відсутність значного впливу бензамілу на різницю у відповіді TGF між STN HS та Sham HS (P = 0,4).

Таблиця 2. Результати SNGFR для експериментів з бензамілом

Значення виражаються як середні значення ± SE. (+) та (-) стосуються максимального та мінімального стимулу TGF. Сер. - SNGFR у середній точці TGF. Відповідь TGF - зміна SNGFR, коли стимул TGF змінився з максимального на мінімальний.

Рис.2.Лінійні графіки відображають зміни швидкості клубочкової фільтрації з одним нефроном (SNGFR) для окремих нефронів. A: SNGFR під час максимальної (+) або мінімальної (-) стимуляції тубулогломерулярного зворотного зв’язку (TGF) за допомогою штучної канальцевої рідини (ATF) або ATF, що містить бензаміл. B: Відповіді TGF (ΔSNGFR) при перфузії петлі Генле з контролем ATF або ATF + бензаміл. C.: середнє значення ± SE для ΔSNGFR. Ефект бензамілу не був статистично значущим між групами або всередині груп.

Таблиця 3. Кореляційна матриця Пірсона для SNGFR у зведених даних експериментів з бензамілом: значення r

Відповіді TGF корелювали між групами (р = 0,45).

Вплив STN на проксимальну реабсорбцію.

Додаткові дані про чисту проксимальну реабсорбцію (Jprox) та фракційну проксимальну реабсорбцію (FRprox) були отримані під час вимірювання TGF-відповіді, реєструючи обсяг разом із кліренсом 3 H-інуліну в кожному пізньому проксимальному збірці канальцевої рідини. Тестування на прямий вплив STN на Jprox та FRprox проводили шляхом аналізу коваріації зі STN як фактором та SNGFR як коваріатом. Аналіз коваріації дає значення для Jprox і FRprox, які скориговані з урахуванням відмінностей у SNGFR. Основні результати повідомляються як ефекти STN на Jprox і FRprox, які є відповідними середніми значеннями для групи після коригування на SNGFR.

Як для серії експериментів LNMMA, так і для бензамілу Jprox і FRprox були меншими в STN HS порівняно з Sham HS (P 5%.

Таблиця 4. Таблиця ANOVA щодо впливу STN та харчового NaCl на проксимальну реабсорбцію

Значення виражаються як середні значення ± SE. Дані накопичені в поточному дослідженні та раніше опублікованих експериментах (13). Jprox'-net проксимальна реабсорбція з поправкою на SNGFR за найменшими квадратами ANCOVA. FRprox́ - дробова проксимальна реабсорбція з поправкою на SNGFR на найменші квадрати ANCOVA. SNGFR був позитивним детермінантом Jprox (P −4). SNGFR був негативним детермінантом FRprox (P −4).

Рис.3.Некоригована необроблена міра чистої проксимальної реабсорбції (Jprox), показана для кожного з 667 пізніх проксимальних трубчастих рідин, об'єднаних з поточних експериментів та раніше опублікованих експериментів у цій моделі (13). SNGFR, швидкість клубочкової фільтрації з одним нефроном. Лінії відображають результати лінійної регресії з 95% довірчими інтервалами.

Рис.4.Нескорегована необроблена міра дробової проксимальної реабсорбції (FRprox), показана для кожного з 667 пізніх проксимальних трубчастих рідин, об'єднаних з поточних експериментів та раніше опублікованих експериментів у цій моделі (13). Лінії показують результати лінійної регресії з 95% довірчими інтервалами. FRprox поступально змінюється із швидкістю клубочкової фільтрації з одним нефроном (SNGFR), що може зробити необроблений FRProx оманливим показником первинного впливу на канальці. Нахили регресії менші при субтотальній нефректомії, при якій не вдається встановити високий FRprox при низькому SNGFR. HS, висока сіль; LS, мало солі.

Основною метою цих експериментів було визначити механізм аномальних TGF-реакцій, що виникають у щурів STN, які харчувались дієтою HS із новими даними мікропунктури, створеними для цієї мети. Вторинною метою було вивчити роль проксимальної реабсорбції в гомеостазі NaCl шляхом комбінування нових і старих даних мікропунктури.

Раніше ми повідомляли, що відповідь TGF є більш неоднорідною у нефронів щурів STN, ніж підставний контроль, коли обох годують стандартною лабораторною дієтою (12). Потім ми показали, що відповідь TGF може бути нормалізована шляхом годування дієтою з низьким вмістом NaCl (LS), але від більш гетерогенної стала відверто парадоксальною, коли щурів STN годували дієтою з високим вмістом NaCl (13). Іншими словами, годування щуром STN дієтою з високим вмістом NaCl перемикало посилення його реакції TGF з негативної на позитивну. Одним із ефектів парадоксального TGF буде зняття гальма, яке нормальний TGF накладає на збільшення дистальної доставки, та полегшення виведення NaCl. Позитивні відгуки посилюють вплив зовнішніх збурень і, отже, за своєю суттю дестабілізуються до будь-якої змінної, на яку вони впливають. Отже, ще одним ефектом парадоксального TGF було б зробити функцію нефрону більш мінливою. Перехід на парадоксальний TGF при STN HS можна розглядати як механізм, за допомогою якого нирка STN готова прийняти зниження функціональної стабільності для виділення великої кількості NaCl на нефрон, як це потрібно для досягнення балансу NaCl. Нормальна нирка, у якої в 6 разів більше нефронів, може досягти рівноваги на дієті ГС при незміненому TGF.

Це дослідження було проведено для вивчення двох можливих механізмів, за допомогою яких дієта з високим вмістом солі перетворює систему TGF з негативних відгуків на позитивні відгуки. Стратегія полягала в тому, щоб побачити, чи зникне різниця у відповіді TGF між Sham та STN, якщо будь-який із цих механізмів буде заблокований. Для досягнення цієї мети нам потрібно було лише вивчити щурів на дієті з високим вмістом NaCl. Отже, усіх тварин у цих дослідженнях годували високим вмістом NaCl.

Отримані нами результати вказують на те, що частина або вся трансформація TGF, спричинена HS в нирці STN, опосередковується пулом оксиду азоту, який можна усунути, просочивши петлю Генле блокатором NOS. На основі відомостей про оксид азоту в нирках, цілком ймовірно, що цей пул оксиду азоту утворюється за допомогою NOS 1 в макулі-денсі (9, 14). Тим часом, наші висновки вказують на те, що жоден вплив HS на TGF не може бути віднесений до cTGF, як описано в недавній літературі.

В даний час ми показали, що перфузія петлі Генле інгібітором синтази оксиду азоту нормалізує відповідь TGF при STN HS, не впливаючи на TGF в Sham HS. Це узгоджується з теорією, згідно з якою залишкова нирка використовує оксид азоту для придушення TGF, що дозволяє збільшити дистальну доставку NaCl при застосуванні дієти з високим вмістом солі. Ці дані також вказують на те, що залишкові нирки не елімінують TGF, пригнічуючи передачу сигналу аденозину A1R, оскільки блокада NOS не нормалізує відповідь судинозвужувального TGF, якби це було так.

Нещодавно надходили повідомлення про те, що cTGF є ще одним регулятором протидії традиційному TGF. Вважається, що cTGF опосередковується судинорозширювальним простагландином, що утворюється у відповідь на поглинання Na через ENaC у сполучній канальці (6). Згідно з цією теорією, має бути можливо отримати парадоксальну відповідь TGF шляхом збільшення коефіцієнта посилення шляху cTGF щодо традиційного шляху аденозину A1R для TGF. Якщо cTGF враховує вплив HS на відповідь TGF у STN, то блокування ENaC бензамілом у STN HS повинно нормалізувати відповідь TGF. У цих експериментах ми перфузували нефрони бензамілом, як описано в літературі (20, 21). Ми не спостерігали впливу бензамілу на відповідь TGF при STN HS, і ми спостерігали незначну тенденцію до того, що бензаміл придушує відповідь TGF у Sham HS, що протилежне тому, що описано в літературі для cTGF (5–8, 20, 21).

Відповіді TGF, отримані нами у підроблених тварин у цих дослідженнях, є типовими для того, що повідомляється для нормальних щурів у всій літературі (оглянуто в посиланні 9). Відповіді TGF в ГСН НС не вимірювались іншими (про що ми знаємо). Зараз ми повторили ті самі експерименти, вимірюючи TGF-відповідь на STN HS у трьох наборах тварин протягом останніх шести років, включаючи один набір, який був раніше опублікований (13). Порівняння відповідей TGF між цими трьома експериментальними серіями ANOVA підсилює враження, що TGF є парадоксальним при STN HS (відповідь TGF = - 4,9 ± 1,6 нл/хв., P = 0,006, n = 68 нефронів) і суттєво не відрізняється між трьома експериментальними серіями (P = 0,6 для неоднорідності між серіями експериментів).

Резюме.

Коли щурів годують дієтою HS після субтотальної нефректомії, реакції TGF стають аномальними, так що збільшення доставки рідини та NaCl до макули призводить до збільшення, а не зменшення SNGFR. Аномальний TGF сприятиме виведенню надлишку NaCl, але також передбачається дестабілізація функції нефрону. Можна сказати, що дієта з високим вмістом NaCl сильно напружує нирку STN до такої міри, що вона порушує її власну стабільність для досягнення балансу солі. Цей аномальний TGF є результатом завищеної реакції оксиду азоту на доставку макули дензи, яка здатна перевершити звичайну реакцію TGF. Ролі cTGF не виявлено. Як вторинний результат, ці дані про мікропунктуру були об'єднані з попередніми даними, щоб сформувати великий набір даних

700 зборів канальцевої рідини зі статистичною потужністю для підтвердження того, що харчовий NaCl викликає значне зменшення реабсорбції в проксимальному канальці STN, що має обмежену здатність підвищувати фракційну реабсорбцію при низьких витратах .

Це дослідження було підтримане Департаментом у справах ветеранів та Університетом Алабами в Бірмінгемі/Каліфорнійським університетом в Сан-Дієго О'Брайен Центр дослідження гострих травм нирок Грант P30-DK-079337.