Нелінійна оптична візуалізація для оцінки впливу ожиріння на молочну залозу та строму пухлини

Інформація про статтю

Ця робота була підтримана грантом Національного інституту охорони здоров'я R21 EB004966-01 для J.X.C., нагородою Trust Showalter 1320046936, грантом Міністерства оборони W81XWH-05-1-0473 та грантом Центру раку Purdue ACS IRG 58-006-47 для I.G.C.

Адресати запити на передрук: Джи-Сінь Чен, доктор філософії, Школа біомедичної інженерії Уелдона, 206 Інтрамурал-драйв, Вест-Лафайєт, IN 47907; e-mail: [електронна пошта захищена]. Ігнасіо Г. Камарілло, доктор філософії, Департамент біологічних наук, 915 West State Street, West Lafayette, IN 47907; e-mail: [електронна пошта захищена] .

Анотація

Ожиріння є встановленим фактором ризику захворюваності на рак молочної залози та смертності. Однак механізм, який пов'язує ожиріння з пухлиною, недостатньо вивчений. Тут ми поєднали нелінійні технології оптичної візуалізації з раннім початком дієти, обумовленим ожирінням, на тваринах з раком молочної залози, щоб оцінити вплив ожиріння на склад молочної залози та строми пухлини. Використовуючи когерентне анти-стоксове раманівське розсіювання та генерацію другої гармоніки на тій же платформі, ми одночасно знімали адипоцити молочної залози, капіляри крові, колагенові фібрили та пухлинні клітини без будь-якого маркування. Ми спостерігали, що ожиріння збільшує розмір крапель ліпідів адипоцитів у молочній залозі та вміст колагену в стромі пухлини молочної залози відповідно. Такі наслідки ожиріння на строму молочної залози та пухлини неможливо проаналізувати за допомогою стандартної двовимірної гістологічної оцінки. Враховуючи важливість строми молочної залози для росту та міграції пухлинних клітин, наше спостереження дає перші докази зображень, які підтверджують взаємозв'язок між ожирінням та ризиком раку молочної залози.

Ожиріння є встановленим фактором ризику для ряду захворювань людини, таких як діабет, хвороби серця та рак молочної залози. 1,2 Недавнє швидке зростання ожиріння серед дітей вказує на те, що негативні наслідки ожиріння на здоров’я людей будуть основною проблемою найближчого майбутнього. Зокрема, ризик раку молочної залози значно зростає при підвищеному індексі маси тіла (> 30 кг/м 2). 2,3 Незважаючи на добре встановлену зв'язок, зв'язок між ожирінням та раком молочної залози недостатньо зрозумілий. Типовим підходом до вивчення раку молочної залози є дослідження мутацій онкогенів. 4 Однак процес, в якому нормальна клітина перетворюється на рак, зумовлений не тільки внутрішніми клітинними подіями, такими як генетичні мутації, але й зовнішніми факторами в мікросередовищі. 5 Фенотипова поведінка ракових клітин, така як проліферація та інвазія, регулюється компонентами позаклітинного матриксу (ECM) та розчинними секретованими факторами оточуючих стромальних клітин. 5–7 Динамічна взаємодія ракових клітин та місцевого середовища відіграє вирішальну роль у їх виживанні та переростанні в злоякісну пухлину. 6,8 Порушення цих взаємодій стало життєздатною терапевтичною стратегією лікування раку в останні роки. 9,10

Для подальшого розуміння впливу мікросередовища на пухлину молочної залози ми використовували нелінійну оптичну (NLO) візуалізацію для характеристики строми тканин молочної залози та пухлини. Хоча гістологічні дослідження дозволяють аналізувати тонкі зрізи біопсії тканин, їм не вистачає тривимірної інформації, важливої для опису стромальної організації в їх природному стані. З іншого боку, мікроскопія NLO успішно продемонструвала можливість глибокої візуалізації тканин із тривимірною роздільною здатністю. 11 За допомогою мікроскопії другої гармонічної генерації (SHG) та двофотонної флуоресценції збудження (TPEF) ряд дослідницьких груп зробили зображення колагену I типу, пухлинних клітин, що експресують зелений флуоресцентний білок, та мічених барвниками судин у живих тварин. 12–16 Для молекул, які не переносять маркування флюорофором, когерентна анти-Стоксове розсіювання (КАРС) забезпечує високочутливу вібраційну техніку візуалізації. 17 Нещодавно CARS успішно застосовується для зображення ліпідних доменів, клітинних мембран, оболонки аксонального мієліну в живих тканинах та адипоцитів у живих тварин. 18–21 Тут ми поєднуємо мікроскопію CARS, SHG та TPEF у мультимодальну платформу для зображення компонентів молочної строми, таких як адипоцити, фібрили колагену, кровоносні судини та інші.

Зокрема, ми запитали, як ожиріння впливає на склад молочної залози та строми пухлини, що призводить до спостерігається взаємозв'язку між ожирінням та високим ризиком раку молочної залози. 3,22 Для вирішення цього питання ми використовували модель щурів Спраг-Доулі із ожирінням, спричиненим дієтою, що ожиріло рано (DIO; див. Методи; Рисунок S1 *). 23,24 моделі DIO на тваринах використовувались для вивчення багатьох захворювань, пов’язаних із ожирінням. 25 Ми спочатку поставили групу молодих щурів на західну дієту з високим вмістом жиру, щоб викликати ожиріння, а іншу групу - на дієті з худими щурячими чау, яка служила контролем. Потім ми обробляли одну групу щурів метилнітрозосечовиною (MNU), хімічним канцерогеном, що індукує пухлини молочної залози, а іншу групу контрольних щурів фізіологічним розчином. 26 У визначений час (див. Методи) ми збирали тканини молочної залози та пухлини для візуалізації NLO (Рисунок S2). На основі візуалізації адипоцитів CARS та візуалізації SHG колагенових фібрил ми спостерігали, що ожиріння збільшує розмір крапель ліпідів адипоцитів у молочній залозі та вміст колагену в стромі пухлини молочної залози. Вплив ожиріння на адипогенез та вміст колагену повинен сприяти нашому розумінню встановленої, але механічно невизначеної ролі ожиріння на рівень захворюваності та смертності від раку молочної залози.

Матеріали і методи

Модель тварини

Обслуговування тканин

Тканини молочної залози та пухлини розрізали на невеликі шматочки розміром 2 × 2 × 2 мм і зберігали в мінімальному основному середовищі Eagle (EMEM), доповненому 10% фетальної бичачої сироватки та 1% пеніциліну-стрептоміцину в інкубаторі при 37 ° C з 5% CO2. Тканини молочних залоз знімали протягом 7 днів після забору. Тканини пухлини молочної залози або зберігали в EMEM для візуалізації протягом 24 годин після забору тканин, або зберігали замороженими в рідкому азоті для візуалізації пізніше (Рисунок S3).

Підготовка гістології

Тканини молочної залози та пухлини фіксували у розчині 10% забуференного формаліну. Після фіксації тканини обробляли і вкладали в парафінові блоки. Зрізи тканин товщиною 5 мкм готували і фарбували гематоксилін-еозином.

Нелінійне оптичне зображення

Стан візуалізації

Камера зі скляним дном, що містить тканини, занурені в середовище для технічного обслуговування, була поміщена на мікроскоп для візуалізації при кімнатній температурі. Для візуалізації CARS загальна потужність стоксових та насосних лазерів на зразку була встановлена на рівні 4 мВт. Для візуалізації СГГ свіжих тканин та зрізів тканин гістології потужність лазера встановлювали на рівні 40 мВт та 16 мВт на 795 нм відповідно. Для зображень TPEF потужність лазера була встановлена на рівні 16 мВт при 795 нм.

Оцінка вмісту стромального колагену в молочних залозах

Об'єм аналізу визначається з розмірами 250 мкм (x) × 250 мкм (y) × 40 мкм (z), при цьому z = 0 є покривним ковзанням та тканиною (рис. S4). Для кожного обсягу аналізу було отримано 81 кадр по осі z з фіксованим розміром кроку 0,5 мкм. Були оцінені дев'ять різних обсягів, і загальна інтенсивність ГСГ (мінус інтенсивність фону) з 729 кадрів (9 × 81 кадрів) була використана для визначення висновку про вміст колагену молочної строми у кожної тварини. Фонову інтенсивність збирали з аналітичного об'єму, позбавленого будь-якого колагену. Потужність лазера на зразку та висока напруга ФМТ були постійними для всіх вимірювань.

Вимірювання діаметрів крапель ліпідів адипоцитів

Адипоцити в тканинах молочної залози щурів, оброблених фізіологічним розчином, сканували вздовж осі z з розміром кроку 0,5 мкм за допомогою мікроскопії CARS. Зафіксовано найбільші виміряні значення діаметра крапель ліпідів на екваторіальних зрізах. Сто адипоцитів у молочній стромі кожного щура оцінювали для отримання середнього діаметра крапель ліпідів (таблиця S1).

Результати

Рисунок 1. Нелінійне оптичне зображення молочної залози та стромального складу пухлини. A, Адипоцити та кровоносні капіляри (стрілки), зображений з когерентним антистоксовим розсіюванням (червоний) та колагенові фібрили, зображені з генерацією другої гармоніки (SHG) (зелений) в молочній залозі. B, Капіляри крові та макрофаги, пофарбовані кон'югованим ізолектином В4 флуоресцеїну ізотіоціанатом та зображені з двофотонною флуоресценцією збудження (TPEF) (сірий). Фібрили колагену візуалізували за допомогою SHG (зелений). C., Адипоцит (червоний) та колагенові фібрили (зелений) організація в молочній залозі. D-F, Організація пухлинних клітин (червоних) та колагенових фібрил (зелений) вздовж вертикальної осі строми пухлини молочної залози. Зображення, зроблені з об'єктивом занурення у воду 60 ×. Шкала шкали = 25 мкм.

Рисунок 2. Когерентне анти-стоксове раманівське розсіювання зображень адипоцитів (червоний) та візуалізація колагенових фібрил другої гармоніки (зелений) для оцінки впливу ожиріння на стромальний склад молочної залози та пухлини. Репрезентативні зображення (одинарні кадри) (A) молочна залоза одного худого щурячого пацюка (LRC1), (B-D) строма пухлини молочної залози трьох нежирних щурячих щурів-пацюків (LRCT1, LRCT2, LRCT3), (Е) молочна залоза одного ожирілого західного щура (OW1), і (F-H) строма пухлини молочної залози трьох ожирених західних пухлинних щурів (OWT1, OWT2, OWT3). Зображення, зроблені з об'єктивом занурення у воду 60 ×. Шкала шкали = 25 мкм.

Рисунок 3. Аналіз впливу ожиріння на склад молочної залози та пухлинний стромальний склад. Тканини молочної залози та пухлини трьох щурів з кожної групи тварин аналізували на вміст колагену та діаметр крапель ліпідів (LD) адипоцитів. A, Загальна інтенсивність колагену другої гармоніки (СГГ) у молочній залозі та стромі пухлини. B, Середній діаметр ЛД 100 адипоцитів у молочних залозах. Смужки помилок представляють стандартні відхилення від середніх значень.

Рисунок 4. Когерентне анти-стоксове раманівське розсіювання зображень ліпідів (червоний) та візуалізація колагенових фібрил другої гармоніки (зелений) стандартних гістологічних зрізів тканини. Гістологія молочної залози (A) худий щурячий пацюк (LRC), (B) ожиріла західна щур (OW) та пухлини молочної залози (C.) худий щур пухлини чау (LRCT) та (D) ожиріння західних пухлинних щурів (OWT). Зображення, зроблені з повітряною об'єктивом 20 ×. Шкала шкал = 75 мкм.

Обговорення

Підводячи підсумок, об’єднавши SHG, TPEF та CARS в єдину мультимодальну платформу, ми продемонстрували унікальні переваги NLO візуалізації раку молочної залози у свіжих тканинах. Зокрема, CARS та SHG дозволили нам візуалізувати клітину пухлини та важливі компоненти строми пухлини, такі як кровоносні капіляри, адипоцити та колагенові фібрили, без необхідності маркування. Враховуючи можливість багатофотонної мікроскопії для візуалізації живих тварин, 12,13,15,21 можна уявити, що розвиток пухлини молочної залози може бути зображений як функція часу неінвазивно. Подальша робота, яка співвідносить склад і структурну організацію пухлини молочної залози з гістологічною оцінкою агресивності пухлини, повинна закласти основу для використання мультимодальної візуалізації NLO для діагностики фенотипу пухлини молочної залози.

Подяка

Ми вдячні Джонатану Саткліфу та Хонтао Чену за допомогу в експериментах із зображеннями та Хан-Вей Вану за схему експериментальної установки. Ми також вдячні Терезі Саламе, Крісу Готфріду та Джулі Вільмовскі за допомогу в утриманні тварин та підготовці тканин.

*
Рисунки та таблиці, позначені символом “S”, є додатковими та можуть переглядати їх лише учасники та передплатники за адресою .

*
Додаткові фільми можуть переглядати Інтернет лише учасники та передплатники за адресою .