Модель ксенотрансплантата раку молочної залози людини означає, що рецептор, активований пероксисомним проліфератором, сигналізує як драйвер викликаної раком м’язової втоми

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Анотація

Призначення: Це дослідження перевірило гіпотезу про те, що ортотопічний ксенотрансплантат (PDOX), отриманий пацієнтом, рекапітулює загальне клінічне явище стомленості скелетних м’язів (SkM), спричиненого раком молочної залози, за відсутності втрати м’язів. Це дослідження додатково прагнуло виявити драйвери цього стану, щоб полегшити розробку терапевтичних засобів для пацієнтів з раком молочної залози, які відчувають м'язову втому.

Експериментальний дизайн: Вісім самок мишей, що несли BC-PDOX, були отримані шляхом трансплантації пухлинної тканини від 8 пацієнток із раком молочної залози. Окремі м'язи задніх кінцівок від мишей BC-PDOX були виділені під час евтаназії для секвенування РНК, аналізу генів та білків та протоколу скорочення м'язів ex vivo для кількісної оцінки індукованих пухлиною аберацій у функції SkM. Диференціально експресовані гени (DEG) у мишей BC-PDOX щодо контрольних мишей були ідентифіковані за допомогою DESeq2, і для контекстуалізації DEG використовувались різні платформи біоінформатики.

Результати: Ми виявили, що SkM від мишей, що несуть BC-PDOX, демонструє більшу втомлюваність, ніж контрольні миші, незважаючи на відсутність різниці в абсолютній м'язовій масі. PPAR, mTOR, IL6, IL1 та декілька інших сигнальних шляхів були залучені до змін транскрипції, що спостерігаються у BC-PDOX SkM. Більше того, 3 незалежних аналізи silico виявили, що сигналізація PPAR є сильно дисрегульованою в SkM як мишей, що несуть BC-PDOX, так і пацієнтів із раною молочної залози на ранній стадії.

Висновки: У сукупності ці дані демонструють, що модель BC-PDOX рекапітулює очікувану втомлюваність SkM, спричинену раком молочної залози, і додатково ідентифікує аберрантну сигналізацію PPAR як невід'ємний фактор патології цього стану.

Трансляційна актуальність

Втомлюваність скелетних м’язів, пов’язана з раком, є загальною проблемою в клінічній онкології, яка часто пов’язана з раковою кахексією, але не спостерігається виключно у кахектичних пацієнтів. Більшість пацієнтів з раком молочної залози повідомляють про втомлюваність м’язів, незважаючи на те, що кахексія є відносно рідкою у цій популяції пацієнтів, особливо у пацієнтів з неметастатичними захворюваннями. Клінічно значущий фенотип м’язової втоми за відсутності відвертої кахексії не має встановленої модельної системи та затверджених терапевтичних засобів. Тут ми використовуємо ортотопічний ксенотрансплантат (BC-PDOX), отриманий пацієнтом із раку молочної залози, для рекапітуляції людського фенотипу індукованої пухлиною м’язової втоми без втрати м’язів. Біоінформатичний аналіз на кількох платформах визначає передачу сигналів PPAR як центральну для транскрипційних змін, що спостерігаються в скелетних м’язах як мишей, що несуть BC-PDOX, так і пацієнтів, хворих на рак молочної залози. Ці дані дозволяють припустити, що фармакологічні засоби, націлені на ізоформи PPAR, такі як затверджені FDA тіазолідиндіони (TZD), можуть мати клінічну користь для пацієнтів з раком молочної залози, які відчувають втому м’язів.

Вступ

Кахексія клінічно визнана наслідком запущеного раку протягом тисячоліть (1) і визнана причиною смерті у значної частини хворих на рак протягом майже 100 років (2). Незважаючи на таку довгу історію, механістичні основи цього руйнівного стану залишаються недостатньо вивченими, і лікувальних препаратів не існує (3). Фактором, що ускладнює лікування кахексії раку, є її багатофакторний характер, який не піддається легкому визначенню, але більшість сходяться на думці, що кахексія включає певну комбінацію втрати ваги, запалення та порушення обміну речовин (4, 5). Для лікування цього синдрому необхідний багатофакторний підхід до лікування (6–9), який повинен враховувати потенційно різні патології, що сприяють втраті ваги, втраті м’язової тканини та м’язовій втомі (10).

Дисфункція SkM у хворих на рак часто вважається наслідком втрати м’язів. Однак великий відсоток жінок із раком молочної залози повідомляє про втому (11–14), незважаючи на мишей scid Il2rg tm1 Wjl/SzJ/0557 (NSG) (рис. 1А), як описано раніше (24, 25). Коротко, самкам мишей NSG знеболювали ізофлураном. На нижній бічній черевній стінці зробили розріз, під шкіру відкрили 3-мм кишеню, щоб оголити жирові прокладки молочної залози, і одиничний фрагмент пухлини розміром 2 мм 3 помістили в кишеню. Зростання пухлини оцінювали ветеринарні працівники на основі затвердженої Політики розвитку та моніторингу пухлин ВВУ.

Створення моделі BC-PDOX. Аналіз SkM від мишей BC-PDOX порівняно з контролем NSG вказує на широке транскрипційне перепрограмування транскриптома SkM у відповідь на ріст пухлини. A, Принципова схема, що описує створення моделей BC-PDOX (P0) та пасажування пухлини для отримання досліджуваних тварин (P0-P2). B, Нормалізована теплова карта експресії генів, що показує диференційовані схеми експресії 50 найбільш диференційовано експресованих генів між BC-PDOX (n = 4) та контрольними мишами NSG (n = 4), організованими згідно з неконтрольованим кластерним аналізом. C., Аналіз основних компонентів, який показує, що транскрипційні профілі NSG та BC-PDOX SkM кластеруються окремо, вказуючи на те, що ріст пухлини викликає транскрипційні зміни в SkM.

E0771 модель сингенної пухлини молочної залози

Детальні методи для росту клітин пухлини молочної залози миші E0771 у сингенних мишей C57BL/6 були описані раніше (23). Коротко кажучи, 1 × 10 6 клітин E0771 суспендували в стерильному PBS і ортотопічно імплантували в четверту пахову жирову прокладку молочної залози на лівій стороні експериментальних мишей. Три групи дослідження включали неін'єкційних контрольних мишей (Con; n = 8), мишей, евтаназованих через 2 тижні росту пухлини (2WK, n = 5), та мишей, евтаназованих через 4 тижні росту пухлини (4WK, n = 11). Клітини E0771 були отримані за допомогою MTA (Wake Forest University Health Sciences; липень 2014 р.). Клітини були автентифіковані та перевірені на наявність забруднюючих речовин перед використанням (IDEXX Bioresearch). Експерименти, описані в цій публікації, з використанням клітин E0771 були завершені між січнем 2015 року та червнем 2016 року.

Виділення РНК, секвенування та біоінформатика

Виділення білка

Гомогенати білка отримували з передньої великогомілкової м’язи експериментальних мишей (n = 4 або 5/група), великих грудних м’язів у пацієнтів з раком молочної залози (n = 15) та контролювали пацієнтки, які перенесли операцію на грудях (n = 5), використовуючи 5-мл подрібнювач тканин Wheaton (DWK Life Sciences Inc.) у буфері для лізису тканин (20 ммоль/л Tris HCl (рН = 7,4), 150 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л EDTA, 1% Triton X-100, 10% гліцерину, 1 ммоль/л NaO3V) з 1 × інгібітором пірцевої протеази та фосфатази (Thermo Fisher Scientific). Гомогенати очищали коротким центрифугуванням, а концентрацію білка визначали кількісно з використанням білкового аналізу Pierce Coomassie Plus (Thermo Fisher Scientific) відповідно до протоколу виробника.

Вестерн-блот-аналіз

Гомогенати білків розбавляли до кінцевої концентрації 1 мкг · мкл -1 в 1X буфері зразків NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific). П’ятнадцять 20 мкг загального білка завантажували в лунку, розчинену в NuPAGE Novex 4% -12% гелів Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific). Білки переносили на нітроцелюлозну мембрану, блокували на 1 годину в 1 × TBS, 0,1% Tween20, 5% BSA з наступною інкубацією з первинним антитілом протягом ночі при 4 ° C. Потім мембрани тричі промивали в TBS + 0,1% Tween20 перед нанесенням відповідного вторинного антитіла (Thermo Fisher Scientific) протягом 90 хвилин при кімнатній температурі, і ще раз перед нанесенням пірсинг-субстрату для промокання Pierce ECL (Thermo Fisher Scientific). Відносну інтенсивність смуги визначали кількісно за допомогою GE Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences) і нормалізували до GAPDH. До первинних антитіл належали такі: фосфо-Stat5 (# 9314S; RRID: AB_2302702), фосфо-Stat3 (# 9138S; RRID: AB_331261), Stat5 (# 9363S; RRID: AB_2196923), Stat3 (# 9139S; RRID: AB_331757), PPARγ (# PA3–821A; RRID: AB_2166056) і GAPDH (# 2118S; RRID: AB_561053).

qRT-ПЛР

Загальну РНК виділяли із шлунково-м’язових м’язів мишей BC-PDOX (n = 8), контрольних мишей NSG (n = 6), мишей PDOX-Con (n = 5) та великих грудних м’язів пацієнтів з раком молочної залози (n = 20 ) та контролювати пацієнтів жіночої статі (n = 10), як описано вище. Два мкг кДНК були отримані за допомогою системи первинного ланцюга синтезу Invitrogen SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) згідно з протоколом виробника, а відносна експресія вибраних генів була проаналізована за допомогою SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) з Applied Biosystems 7500 Система ПЛР у режимі реального часу (Thermo Fisher Scientific). Було визначено, що ефективність праймера становить від 90% до 110%, а відносну експресію мРНК розраховували за допомогою методу Пфаффа (32). Праймери qRT-PCR (Додаткова таблиця S1) були розроблені з використанням Primer3 (33).

Фізіологічний аналіз м’язів ex vivo

Статистичний аналіз

GraphPad Prism (V5; RRID: SCR_002798) був використаний для аналізу наступних наборів даних. Використовували тест Стьюдента (α = 0,05) для порівняння засобів для експресії білка за допомогою Вестерн-блоттингу та log2-трансформованих змін складок [log2 (FC)] у експресії мРНК у зразках людини. Одностороння ANOVA була використана для порівняння log2 (FC) у експресії мРНК у зразках мишей, вазі м’язів та вибраних властивостях скорочення м’язів, включаючи AUC, Lo, ізометричну силу, КТ, ½ RT, швидкість продукування сили та швидкість розслаблення . Двосторонній ANOVA був використаний для порівняння відмінностей між групами у виведенні сили протягом часу протягом 6-хвилинного протоколу втоми. Належність (r 2) для взаємозв'язку між активацією STAT3 та STAT5 (наприклад, pSTAT3/загальний STAT3) щодо кожного фізіологічного параметра аналізували за допомогою функції лінійної регресії GraphPad Prism, порівнюючи лінію лінійної регресії, що найкраще підходить, до H0 де найкраще підходить лінія - це горизонтальна лінія (тобто m = 0) через середнє значення всіх значень Y (n = 8, об'єднані NSG та BC-PDOX).

Результати

Аналіз шляхів та фактора транскрипції RNA-Seq у скелетних м'язах на моделі миші BC-PDOX

М'язову тканину 4 мишей, що несли унікальні пухлини BC-PDOX, що представляли 4 різних пацієнтів, використовували для RNA-Seq (Додаткова таблиця S2) та порівнювали з м'язовою тканиною у непухлинних контрольних мишей NSG. Неконтрольований кластерний аналіз виявив унікальну транскрипційну сигнатуру, присутню в м'язі BC-PDOX, із загальною тенденцією зниження транскрипції (рис. 1B), що підтверджує нашу раніше опубліковану транскрипційну сигнатуру SkM у пацієнтів на ранній стадії раку молочної залози (23). Аналіз основних компонентів (PCA) показує кластеризацію транскрипційних підписів BC-PDOX SkM, окремо від більш жорстких кластерних елементів управління (рис. 1C).

IPA визначив кілька канонічних шляхів як нерегульованих у цій моделі, причому кілька ідентифікованих шляхів раніше були причетні до кахексії раку та дисфункції м’язів в інших моделях, включаючи передачу сигналів через PPAR, mTOR, IL1 та IL6. IPA додатково визначив кілька шляхів, які ще не пов'язані з кахексією раку, і тому вимагає подальших досліджень в контексті індукованої пухлиною дисфункції SkM, таких як передача сигналів інтегрину та розривів. Цікаво, що IPA передбачав відсутність суттєвої дисрегуляції в межах 3 шляхів, які в інших моделях сильно впливали на кахексію раку (рис. 2А). Провісник активності молекули IPA (MAP) передбачав пригнічення м’язового скорочення, спричинене аберрантним вивільненням кальцію із саркоплазматичної сітки (рис. 2B). MAP додатково передбачав зниження генерації АТФ у SkM через зменшення активності комплексів електронно-транспортних ланцюгів IV та V (рис. 2C).

BC-PDOX викликає втому SkM. A, Середні криві втоми SkM ex vivo, створені для контрольних тварин NSG (NSG, n = 6), хірургічних контрольних тварин (PDOX-CON, n = 5) та мишей BC-PDOX (n = 6), використовуючи м'яз EDL. Зсув кривої втоми BC-PDOX вліво вказує на більшу втомлюваність. На діаграмі представлені середній показник втоми ± SEM для кожного 10-го скорочення в протоколі втоми; PDOX-CON порівняно з групами PDOX порівняно за допомогою двостороннього ANOVA. B, AUC для кривих втоми, представлених у A. C., Криві першої похідної, створені для кривих втоми, представлених у A, що представляє швидкість зміни сили, що виводиться на м'яз EDL. D, Абсолютні порівняння маси EDL, підошви, шлунково-кишкового та великогомілкової кісток передньої м’язи у мишей BC-PDOX, мишей NSG та PDOX-CON, не показавши суттєвих відмінностей; *, P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Ex vivo ізометричні скорочувальні параметри в м’язі EDL

Обговорення

У цьому дослідженні перевірено гіпотезу про те, що модель миші BC-PDOX рекапітулює загальне клінічне явище, спричинене раком молочної залози, стомленістю SkM за відсутності втрати м’язів. Ми виявили, що миші, що несуть BC-PDOX, справді демонструють більшу втомлюваність SkM, ніж непухлинні контрольні миші NSG та миші PDOX-Con, незважаючи на відсутність різниці в абсолютній м'язовій масі. Потім ми виявили, що SkM від мишей, що несуть BC-PDOX, демонструє широкомасштабні транскрипційні зміни, включаючи зміни в шляхах, про які раніше повідомлялося, що мають відношення до кахексії раку (наприклад, PPAR, mTOR, IL6, IL1), а також про такі, про які ніколи не повідомлялося в цей стан (наприклад, сигналізація через інтегрини та щілинні переходи). Ці дані підтверджують використання BC-PDOX як моделі дисфункції SkM, спричиненої раком молочної залози, та визначають нові терапевтичні цілі для поліпшення роботи м’язів у пацієнтів з раком молочної залози.

Нещодавній звіт про кількісну оцінку дефіциту SkM у самців мишей APC Min/+ під час прогресування кахексії аналогічним чином виявив більш повільний, більш втомлюваний фенотип у SkM стійких до ваги мишей, причому активація STAT3 корелювала із змінами швидкості скорочення та релаксації посмикування (39) . У нашій моделі BC-PDOX ми спостерігали зміни в швидкості скорочення та розслаблення посмикування за відсутності активації STAT3, і активація STAT3 не корелювала з жодним показником скорочувальної здатності м’язів, отриманим від мишей BC-PDOX. Ця невідповідність вказує на те, що, хоча запалення корелює із уповільненням фізіології SkM в 1 моделі, сигналізація про запалення через STAT3, ймовірно, не пов’язана із сповільненими параметрами скорочення м’язів, що спостерігаються у мишей BC-PDOX.

У сукупності наші дані показують, що індуковану раком молочної залози дисфункцію м’язів можна ефективно рекапітулювати та вивчити на моделі BC-PDOX. Загальне уповільнення та більша швидкість втоми швидкого м’яза EDL у поєднанні зі зміненою експресією кількох ключових регуляторів обробки кальцію SkM свідчать про те, що зміни в роботі з кальцієм сприяють повільному, втомлюваному фенотипу, індукованому ростом пухлини. Крім того, 3 незалежних аналізи silico виявили, що сигналізація PPARγ є сильно дисрегульованою як у BC-PDOX SkM, так і в м’язах пацієнтів з раком молочної залози на ранніх стадіях, припускаючи, що агоністи PPAR можуть мати клінічну користь для пацієнтів з раком молочної залози, які переживають втому. На закінчення, сигналізація PPAR, особливо PPARγ-сигналізація, ймовірно, опосередковує значну частину впливу пухлини молочної залози на SkM. Потрібні подальші дослідження, щоб визначити, чи можуть агоністи PPAR забезпечити користь для життя пацієнтам з раком молочної залози з дисфункцією м’язів. Враховуючи, що профіль побічних ефектів цих препаратів є відносно доброякісним, агоністи PPAR можуть виявитися корисними в якості додаткової терапії для полегшення індукованої раком м’язової втоми.

Розкриття потенційного конфлікту інтересів

Жодного потенційного конфлікту інтересів не розкрито.

Застереження

За вміст відповідають виключно автори, і він не обов'язково відображає офіційні погляди NIH.