Мірра індукує апоптоз та інгібує проліферацію та міграцію ракових клітин шлунка через регулюючу зниження експресію циклооксигеназу-2

Менгсуе Сун, Цзе Хуа, Гаошуан Лю, Пейюн Хуан, Ніншенг Лю, Сяопу Хе; Мірра індукує апоптоз та інгібує проліферацію та міграцію ракових клітин шлунка за допомогою знижуючої експресії циклооксигенази-2. Biosci Rep 29 травня 2020 р .; 40 (5): BSR20192372. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20192372

Завантажити файл цитування:

Анотація

Завдання: Це дослідження призначене для оцінки протипухлинних ефектів смири на рак шлунка людини як in vitro, так і in vivo. Методи: Проліферацію клітин раку шлунка визначали методом МТТ. Апоптоз вимірювали за допомогою проточної цитометрії та фарбування Hoechst 33342. Загоєння ран проводили для оцінки впливу смири на міграцію. Експресії COX-2, PCNA, Bcl-2 та Bax були виявлені за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Для оцінки протиракового ефекту смири in vivo була встановлена модель оголених мишей-ксенотрансплантатів раку шлунка людини. Результати: Миро суттєво пригнічувало клітинну проліферацію, міграцію та індукований апоптоз in vitro, а також пригнічувало ріст пухлини in vivo. Крім того, смирна пригнічувала експресію PCNA, COX-2 та Bcl-2, а також підвищувала експресію Bax у клітинах раку шлунка. Висновок: Миро може пригнічувати проліферацію та міграцію ракових клітин шлунка, а також індукувати їх апоптоз, знижуючи регуляцію експресії ЦОГ-2.

Вступ

У всьому світі рак шлунка (ГХ) є найбільш діагностованою злоякісною пухлиною та другою провідною причиною смерті, пов’язаної з раком [1,2]. Незважаючи на безліч варіантів лікування, таких як хірургічне втручання, променева терапія, звичайна хіміотерапія, молекулярна, біологічна терапія та цілеспрямована терапія [3,4], прогноз ГХ залишається поганим. Досі необхідні нові методи лікування раку шлунка.

Миро, смолистий ексудат сімейства комміфори [5], давно використовується для лікування запальних захворювань. Численні фармакологічні дослідження досліджували його протизапальні механізми. Гуггулстерон, основний функціональний екстракт мирри, пригнічує ріст пухлини ГХ на тваринних моделях та підвищує хіміочутливість клітин раку молочної залози [6,7]. Крім того, Commiphoramyrrha індукує апоптоз раку передміхурової залози людини та клітин гепатоцелюлярної карциноми [8–10]. Однак ефективність смири при лікуванні ГХ не вивчалась. Це дослідження є першою спробою вивчити вплив смири на морфологію клітин GC

Циклооксигеназа (ЦОГ) є потенційною мішенню в лікуванні та профілактиці пухлин [11]. У ГХ ЦОГ-2 бере участь у пов'язаних з пухлиною процесах, таких як ангіогенез, інвазія та ухилення від імунітету, і вказує на гістологічний підтип, розмір пухлини та стадію розвитку [12]. COX-2 надмірно експресується в клітинах GC людини і пов'язаний із поганою загальною виживаністю [13,14]. Селективні інгібітори циклооксигенази-2 (ЦОГ-2) пригнічують проліферацію та індукують апоптоз клітин GC [15]. У цьому дослідженні дві людські клітинні лінії GC BGC-823 та SGC-7901 були застосовані для оцінки протипухлинного впливу смири на рак шлунка людини. Крім того, були виявлені експресії ЦОГ-2, проліферуючий клітинний ядерний антиген (PCNA) та пов'язані з апоптозом білки для подальшого з'ясування прихованого механізму.

Матеріали і методи

Водний екстракт мірри

Миро (# 71202500) було придбано у лікарні традиційної китайської медицини провінції Цзянсу (Нанкін, Китай). Екстракт мирри готували, як описано раніше [16,17]. Порошкоподібну смолу мірри (1,0 кг) екстрагували достатньою кількістю розчинника (2 × 10 л) тривалістю протягом 1 години. Процес екстракції повторювали двічі. Потім витягнутий розчин кип'ятили у пристрої з конденсаційною температурою зі зворотним холодильником протягом 2 год, природним чином охолоджували до кімнатної температури і центрифугували при 3500 об/хв протягом 20 хв для видалення залишків. Потім надосадову рідину випарювали у роторному випарнику протягом 12 год для отримання порошку мирри. Для приготування відвару з екстрактів мирри 100 мг порошку мирри розчиняли у 5 мл PBS (для експерименту in vivo) або середовища культури клітин (для експерименту in vitro) на водяній бані при 90 ° C – 100 ° C протягом 12 год. Суміш центрифугували при 10000 об/хв протягом 20 хв (двічі) з отриманням супернатанту, пропускали через фільтр 0,22 мкм і зберігали при 4 ° C.

Клітинні лінії та клітинна культура

Погано диференційовані BGC-823 та помірно диференційовані SGC-7901 людські клітинні лінії були отримані від Шанхайського інституту клітинної біології (Шанхай, Китай). Усі клітини регулярно культивували в середовищі RPMI 1640 (BioInd, Ізраїль), доповненій 10% фетальною бичачою сироваткою (FBS) та 1% пеніциліном/стрептоміцином (Gibco, Карлсбад, Каліфорнія, США). Всі клітини витримували при 37 ° С у зволоженій атмосфері 5% -ного інкубатора СО2.

МТТ аналіз

Вплив смири на життєздатність клітин ГХ визначали за допомогою аналізу 3– (4,5 – диметилтіазол – 2 – іл) -2,5 – дифенілтетразолію броміду (МТТ, Sigma). Клітини BGC-823 та SGC-7901 висівали на 96-лункову мікропланшет (4 × 10 3 клітини на лунку) та інкубували протягом ночі у 10% середовищі FBS. Через 24 год клітини інкубували з різними концентраціями мирри (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 та 3 мг/мл) протягом 12, 24 або 48 год при 37 ° С. Безклітинне середовище використовували як пустий контроль. Згодом у кожну лунку додавали 200 мкл розчину МТТ (0,5 мг/мл) та інкубували протягом 4 год при 37 ° С. Потім у кожну лунку додавали 200 мкл диметилсульфоксиду (DMSO, Sigma). Ефекти інгібування проліферації кожної комбінації оцінювали за допомогою зчитувача мікропланшетів (MJ Research Inc.) при 570 нм [18].

Аналіз проточної цитометрії

Апоптоз клітин GC вимірювали за допомогою проточної цитометрії, використовуючи Додаток V, FITC Kit для виявлення апоптозу (Dojindo, Японія). Для кожної обробки збирали 2 × 105 клітин (0, 1, 1,5 та 2 мг/мл смири протягом 24 год) і двічі промивали, використовуючи холодний сольовий соль, забуференний фосфатом (PBS). Потім клітини ресуспендували в 0,6 мл зв’язуючого буфера і давали реагувати з 10 мкл міченого FITC анексину V і 10 мкл йодиду пропідію (PI) протягом 15 хв при кімнатній температурі в темряві. Потім клітини аналізували на проточному цитометрі (Бектон Дікінсон, Каліфорнія, США). Апоптоз оцінювали за допомогою анексину V-FITC та фарбування йодидом пропідію.

Фарбування Hoechst 33342

Морфологічні зміни були продемонстровані флуоресцентною мікроскопією з використанням фарбування Хохста. Клітини BGC823 та SGC7901 обробляли різними концентраціями мірри (0, 1, 1,5 та 2 мг/мл протягом 24 год), двічі промивали PBS та фіксували. Після двічі промивання PBS протягом 3 хв клітини фарбували 10 мкг/мл Hoechst 33342 (Beyotime, Китай) протягом 5 хв при кімнатній температурі та досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії (Eclipse E-800; Nikon, Токіо, Японія). Апоптотичні клітини ідентифікували за допомогою ядерної фрагментації та конденсації хроматину.

Аналіз загоєння ран in vitro

Клітини BGC823 і SGC7901 висівали в шість лункових планшетів і культивували в інкубаторі, поки не утворилися злиті моношари. Клітини голодували сироваткою протягом 12 годин. Подряпини були створені шляхом зіскрібування клітинного шару по кожній культуропластинці за допомогою кінчика піпетки 10 мкл. Сміття видаляли промиванням клітин PBS. У цей початковий момент часу (t = 0 год) поля рани спостерігали за допомогою фазово-контрастної мікроскопії та фотографували. Потім до планшетів додавали безсироваткове середовище, що містить 0 або 1 мг/мл миро, і клітини інкубували протягом 48 годин при 37 ° С. Такі самі поля краю рани фотографували через 24 та 48 год.

Аналіз ксенотрансплантата

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот-аналіз проводився, як описано в наших попередніх звітах [19]. Культивовані клітини та пухлинні тканини гомогенізували в буфері лізису RIPA (Biyuntian, Китай) з коктейлем інгібітора протеази. Потім тканинні або клітинні екстракти центрифугували при 12000 об/хв при 4 ° С і збирали фракції супернатанту. Загальний білок визначали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Thermo Scientific, Рокфорд, Іллінойс, США). Зразки білків розчиняли на 10% гелі SDS-PAGE і потім переносили в поліпропіленфторид (Millipore, США). Мембрани блокували в 5% знежиреному сухому молоці, що містить 0,1% Твін-20 в TBST, протягом 2 год при кімнатній температурі. Потім мембрани інкубували при 4 ° С протягом ночі з наступними первинними антитілами. Антитіла: PCNA (1: 4000, Abcam), Bcl-2 (1: 1000, Abcam), Bax (1: 2000, Abcam), COX-2 (1: 2000, Abcam) і GAPDH (1: 10000, Sigma– Олдріч). Після промивання зразки інкубували з кон'югованим HRP козячим анти-кролячим або анти-мишачим IgG при кімнатній температурі протягом 1 години. Сигнали виявляли за допомогою посиленого хемілюмінесцентного реагенту (WBKLS0500, Millipore, США). Всі білкові смуги були кількісно визначені за допомогою програм для аналізу зображень денситометрії (Quantity One, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Відносні вирази PCNA, Bcl-2, Bax та COX-2 були нормалізовані до виражень GAPDH.

Статистичний аналіз

IC50 . . Середнє (SD) . . 12 год. 24 год. 48 год .

BGC823	2,5017 (0,20)	2,0711 (0,26)	1,3578 (0,09)
SGC7901	2,4530 (0,05)	2,2118 (0,34)	1,4624 (0,03)

IC50 . . Середнє (SD) . . 12 год. 24 год. 48 год .

BGC823	2,5017 (0,20)	2,0711 (0,26)	1,3578 (0,09)
SGC7901	2,4530 (0,05)	2,2118 (0,34)	1,4624 (0,03)

Дані представлені як середнє значення ± SD з трьох незалежних експериментів

Миро викликало апоптоз клітин BGC823 та SGC7901

Аналіз AnnexinV-FITC/PI, заснований на проточній цитометрії, проводили для дослідження апортозу, спричиненого мирою (Малюнок 2А). На двофункціональних флуоресцентних точкових ділянках були підраховані клітини у ранньому апоптозі (Анексин V +/ПІ -, Q3) та пізньому апоптозі (Анексин V +/ПІ +, Q2). Мірра викликала апоптоз як клітин BGC-823, так і SGC-7901 залежно від дози (рис. 2C). Для підтвердження цього ефекту ці клітини, оброблені мирою, були ідентифіковані за допомогою ядерного фарбування Hoechst 33342. Як показано на малюнку 2B, ядро клітин GC, оброблених мирою, було ущільнене та фрагментоване, випромінювало яскраву флуоресценцію, що було раннім явищем апоптозу.

Миро викликає апоптоз у клітинах GC

Мирро пригнічувала міграцію клітин BGC-823 та SGC-7901

Досліджено вплив 1 мг/мл смири на міграцію клітин GC. Через 24 та 48 год лікування міррою простір між ранами розширився (рисунок 3), вказуючи тим самим, що загоєння гальмується. Міграційна здатність клітин GC була ослаблена в клітинах BGR-823 та SGC-7901, оброблених мирою.

Миро пригнічує загоєння одношарової рани клітин GC

Мірра змінила експресію PCNA, Bcl-2, Bax та COX-2 у ракових клітинах шлунка

Вплив смири на білки, пов'язані з апоптозом, оцінювали за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Через 24 години лікування міррою експресія проапоптотичного білка Bax регулювалася вгору, а антиапоптотичного білка Bcl-2 - в залежності від дози в клітинах BGC-823 та SGC-7901. Крім того, смирна значно зменшила експресію PCNA та COX-2 залежно від дози у клітинах BGC-823 та SGC-7901 (рис. 4).

Вплив смири на рівень експресії PCNA, Bcl-2, Bax та COX-2

Миро пригнічувало ріст пухлини ксенотрансплантата шлунка in vivo

Вивчали вплив смирну на ксенотрансплантати клітин BGC823 та SGC7901 (рис. 5). Мишей, імплантованих клітинами GC, щодня обробляли смирною протягом 2 тижнів. Протягом 2 тижнів смерть не настала. Не було помітно різниці у вазі тіла між контрольною групою та групами оголених мишей, оброблених мирою (Фігура 5B, F). Середній обсяг пухлини оголених мишей, оброблених смиррою, був помітно нижчим, ніж у контрольних оголених мишей (рис. 5C, G).

Миро пригнічує ріст пухлини шлунка in vivo

Мирро знизило регулювання експресії ЦОГ-2 у моделі GC ксенотрансплантата

Як показано на малюнку 5D, білок Н, ЦОГ-2 надмірно експресувався в тканинах GC контрольних оголених мишей. Внутрішньошлункове введення смири зменшило надмірну експресію ЦОГ-2 у тканинах пухлини оголених мишей, тим самим припускаючи, що смирна може пригнічувати ріст пухлин у оголених мишей, знижуючи регулювання експресії ЦОГ-2 у тканинах GC.

Обговорення

GC - це травна злоякісна пухлина з високим рівнем захворюваності та смертності у всьому світі [20]. Незважаючи на терапевтичне вдосконалення, він залишається провідною причиною смерті, пов'язаної з раком [21]. ГХ можна діагностувати на ранніх термінах за допомогою ендоскопії та лікувати своєчасним хірургічним висіченням, але довготривале виживання пацієнта все ще загрожує високими метастазами, рецидивами та лікарською стійкістю [22–24]. Активні лікарські сполуки з природних джерел забезпечили альтернативні варіанти лікування. Мірра, смолистий ексудат Commiphora Myrrha (Nees) Engl, виявляє протипухлинні властивості in vivo та in vitro [6,9,25]. У цьому дослідженні ми вперше дослідили наслідки смири на проліферацію, апоптоз та міграцію клітин GC.

ЦОГ-2, фермент, який неможливо виявити в більшості нормальних тканин, індукується різними цитокінами, гормонами та факторами росту і сильно експресується у запаленні та пухлинних тканинах [26–28]. ЦОГ-2 викликає злоякісні пухлини, регулюючи вироблення простагландинів, насамперед простагландину Е2 (PGE2). Надмірно виражений ЦОГ-2 бере участь у інвазії та метастазуванні та погіршує прогноз ГХ через безліч шляхів [29,30]. ЦОГ-2 - це потенційна протиракова молекула-мішень для лікування та профілактики злоякісних пухлин [31]. Миро може пригнічувати проліферацію ракових клітин голови та шиї, зменшуючи експресію ЦОГ-2 [32]. У цьому дослідженні вперше досліджено вплив смири на проліферацію та апоптоз клітин GC. Ми показали, що смирна значно знизила експресію ЦОГ-2 у клітинах BGC-823 та SGC-7901.

Туморогенез є результатом дисбалансу між проліферацією клітин та апоптозом [33]. Для уточнення молекулярних механізмів мирри при туморогенезі шлунка експресію білків, пов’язану з проліферацією та апоптозом клітин, досліджували in vitro. Була побудована модель пухлинної миші для спостереження протипухлинного ефекту смири in vivo. PCNA, білок, необхідний для реплікації та пошкодження та відновлення ДНК, є ефективним маркером для оцінки частки росту клітинної колонії [34,35]. Наші експерименти продемонстрували, що смиррозалежне зменшення експресії PCNA в клітинах BGC-823 та SGC-7901. Білки сімейства Bcl-2 беруть участь в антиапоптотичному механізмі і надмірно експресуються при різних злоякісних пухлинах [36]. Bcl-2 та споріднені цитоплазматичні білки є ключовими регуляторами апоптозу клітин. Вони мають інгібуючий характер (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1 та Mcl-1) або прискорювальний (Bax, Bim, Bak та Bcl-XS) [37]. Понижена регуляція експресії ЦОГ-2 може викликати апоптоз ракових клітин шляхом регулювання зниження експресії Bcl-2 та регулювання вгору експресії Bax [38,39].

Наші попередні дослідження продемонстрували, що гармін може регулювати зниження експресії PCNA та COX-2 в ракових клітинах шлунка людини. Крім того, гармін значно підвищує рівень білка Bax та знижує рівень білка Bcl-2 у клітинах GC людини [40]. Наші результати узгоджуються з попередніми дослідженнями і припускають, що смирна пригнічує проліферацію та індукує апоптоз клітин GC, ймовірно, знижуючи експресію COX-2 у клітинах GC. Принципова схема відповідного білка, що представляє інтерес (Фігура 6), показала одночасну регуляцію експресії Bax та зниження експресії Bcl-2 та COX-2 у клітинах GC, оброблених мирою. Результати дослідження in vitro дають докази того, що смирна індукує апоптоз клітин GC залежно від дози. Миро може зменшити швидкість міграції клітин GC in vitro. Більше того, із збільшенням адміністративного часу пригнічення мірри міграції клітин GC може зростати.