miR-192-5p регулює синтез ліпідів при неалкогольній жировій хворобі печінки за допомогою SCD-1

Сяо-Лінь Лю

Цінь Пан та Цзянь-Гао Фань, Центр жирної печінки, відділення гастроентерології лікарні Сіньхуа, що працює при Шанхайській медичній школі університету Цзяо Тун, Шанхай 200092, Китай

Хай-Ся Цао

Бао-Кан Ван

Фен-Чжі Сінь

Цінь Пан та Цзянь-Гао Фан, Центр жирної печінки, відділення гастроентерології лікарні Сіньхуа, що працює при Шанхайській медичній школі університету Цзяо Тун, Шанхай 200092, Китай

Руй-Нань Чжан

Да Чжоу

Руй-Сю Ян

Зе-Хуа Чжао

Листування: Цзянь-Гао Фан, доктор філософії, професор, Центр жирної печінки, відділення гастроентерології, лікарня Сіньхуа, яка працює при Шанхайській медичній школі університету Цзяо Тонг, 1665 Kong Jiang Road, Шанхай 200092, Китай. nc.moc.demauhnix@oagnaijnaf

Анотація

Оцінити рівні miR-192-5p у моделях неалкогольної жирової хвороби печінки (NAFLD) та продемонструвати роль miR-192-5p у накопиченні ліпідів.

МЕТОДИ

Тридцять щурів Sprague Dawley були випадковим чином розділені на три групи, яким давали стандартну дієту, дієту з високим вмістом жиру (HFD) та HFD з ін'єкцією ліраглутиду. Наприкінці 16 тижнів вимірювали рівні печінкової miR-192-5p та стеароїл-КоА десатурази 1 (SCD-1). Мімік та інгібітор MiR-192-5p та міРНК SCD-1 трансфікували в клітини Huh7, що зазнали дії пальмітинової кислоти (PA). Накопичення ліпідів оцінювали за допомогою фарбування олійно-червоного О та аналізів на тригліцериди. Пряма взаємодія була підтверджена за допомогою аналізів репортерних генів подвійної люциферази.

РЕЗУЛЬТАТИ

Щури HFD продемонстрували 0,46-кратне зменшення та 3,5-кратне збільшення рівня білка miR-192-5p та SCD-1 у печінці у порівнянні з контролем відповідно, що може бути скасовано після ремісії захворювання шляхом ін'єкції ліраглутиду (P Ключові слова: miR-192-5p, стеароїл-КоА десатураза 1, дієта з високим вмістом жиру, синтез ліпідів, неалкогольна жирова хвороба печінки

Основна порада: Рівень miR-192-5p у печінці знижувався у моделей безалкогольних стеатогепатитів щурів, які харчувались жирною дієтою, і зменшення могло бути скасовано після ремісії захворювання терапією ліраглутидом. miR-192-5p показав пряму взаємодію зі стеароїл-КоА десатуразою 1 (SCD-1). Надмірна експресія miR-192-5p суттєво полегшила накопичення ліпідів у клітинах Huh7, що зазнали дії ПА, а міРНК SCD-1 скасувала відкладення ліпідів, посилене інгібітором miR-192-5p. Наше дослідження пропонує докази того, що miR-192-5p бере участь у синтезі ліпідів при неалкогольній жировій хворобі печінки (NAFLD) через SCD-1 і припускає, що надмірна експресія miR-192-5p може представляти перспективне лікування НАЖХП.

ВСТУП

Стеароїл-КоА-десатураза 1 (SCD-1) відіграє важливу роль у біосинтезі мононенасичених жирних кислот і служить ключовим регуляторним ферментом на останній стадії ліпогенезу de novo печінки (DNL). Підвищення рівня DNL підтверджено у пацієнтів з НАЖХП порівняно з контролем [15]. Посилена печінкова активність SCD-1 сприяє накопиченню печінкових ліпідів, особливо тригліцеридів (TG), і, отже, призводить до прогресування НАЖХП [16]. Недавні дослідження показали, що експресія SCD-1 може регулюватися за допомогою SREBP-1c-залежного та SREBP-1c-незалежного шляхів [17], але чи можна SCD-1 регулювати мікроРНК у NAFLD, до кінця не вивчено.

Для вирішення вищезазначених питань ми провели це дослідження на щурах, живлених жирною дієтою (HFD), та клітинах Huh7, оброблених пальмітиновою кислотою (PA). Рівень miR-192-5p у печінці та гепатоцелюлітах у НАЖХП оцінювали як in vivo, так і in vitro. Надмірну експресію та нокдаун miR-192-5p проводили в клітинах Huh7 для визначення регуляторних ефектів miR-192-5p при накопиченні ліпідів, а аналізи репортерів люциферази використовували для підтвердження прямої взаємодії між miR-192-5p та SCD-1 . У сукупності ми спробували проілюструвати роль miR-192-5p у метаболізмі ліпідів у печінці при НАЖХП.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Тварини та лікування

Експеримент на тваринах був розроблений, щоб мінімізувати біль або дискомфорт для тварин. Загалом 30 самців щурів Спраг-Доулі (6-тижневого віку) були придбані в Шанхайському експериментальному центрі тварин Академії наук Китаю (Шанхай, Китай) і розміщені в контрольованих температурних умовах (24 ° C ± 2 ° C), вологість (50% ± 5%) та цикл світла/темряви (12 год) із вільним доступом до їжі та води. Після акліматизації протягом тижня на стандартній дієті їх рандомізували на три групи (10 щурів на групу). Контрольна група отримувала стандартну дієту; групу з HFD годували HFD (88% стандартна дієта, 10% сало та 2% холестерину); а терапевтичну групу годували HFD і отримували внутрішньочеревні ін’єкції ліраглутиду (Sigma, Сент-Луїс, США; 0,6 мг/кг у фізіологічному розчині) протягом останніх 8 тижнів. Цей експеримент слідував Посібнику Національної дослідницької ради з догляду та використання лабораторних тварин і був схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин SHRM (SHRM-IACUC-001).

Збір та вимірювання зразків

Наприкінці 16 тижнів щури були евтаназовані після нічного голодування. Частини печінки щурів фіксували протягом ночі у 4% параформальдегіді та вкладали у парафін для гістологічних оцінок із фарбуванням гематоксилін-еозином (H&E). Решта порції швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C для фарбування олійно-червоним O та інших аналізів. Рівні печінкового TG у щурів вимірювали за допомогою аналізного набору (Нанкінський інститут біоінженерії Цзяньчен, Нанкін, Китай) відповідно до інструкцій виробника.

Культура клітин

Клітинна лінія Huh7 була отримана з American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, США) і культивована в модифікованому середовищем орела Дульбекко (DMEM), доповненому 10% плодовою бичачою сироваткою (FBS; Gibco, CA, США) під атмосфера 5% СО2 при 37 ° С. Порошок ПА (Sigma, Сент-Луїс, США) розчиняли у воді Milli-Q з додаванням 1% -ної безжирної BSA (Sigma, Сент-Луїс, США) при 70 ° C і фільтрували через 0,22-мкм фільтр. отримують 5 ммоль/л вихідного розчину ПА. Робочий розчин ПА додавали до клітин при 0,3 ммоль/л і 0,5 ммоль/л.

Виявлення життєздатності клітин

Ми проводили вимірювання життєздатності клітин, використовуючи комплект для підрахунку клітин-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Кумамото, Японія) згідно з інструкціями виробника. Клітини Huh7 висівали на 96-лунковий планшет і додавали 0, 0,3 і 0,5 ммоль/л ПА в культуральному середовищі протягом 8, 16 та 24 год інкубації. Поглинання CCK-8 зчитували при 450 нм, і значення нормалізували до значень контрольної групи.

Масляно-червоне фарбування O та внутрішньоклітинний аналіз TG

Для фарбування олійно-червоним кольором пластинку для культури клітин двічі промивали забуференним фосфатом фізіологічним розчином і фіксували у 10% нейтральному формаліні. Олійно-червоний O (Sigma, Сент-Луїс, США) розчиняли в ізопропанолі у вигляді основного розчину і розбавляли 3: 2 ddH2O для додавання на планшет протягом 15 хв з подальшим промиванням у 60% ізопропанолі. Потім пластинка була фарбована гематоксиліном після промивання в дистильованій воді. Внутрішньоклітинний рівень TG у клітинах Huh7 вимірювали за допомогою набору для аналізу TG (Applygen Technologies Inc., Пекін, Китай) відповідно до інструкцій виробника. Рівень клітинного ТГ нормалізували до вмісту білка.

міРНК та трансфекція малих заважаючих РНК (siРНК)

Клітини Huh7 трансфікували імітацією 50 нмоль/л miR-192-5p (Cat. No: miR10000222; Ribobio, Гуанчжоу, Китай), 200 нмоль/L інгібітором miR-192-5p (Cat. No: miR20000222; Ribobio, Guangzhou, Китай), 50 нмоль/л сиРНК SCD-1 (кат. No: stB0007776A; Ribobio, Гуанчжоу, Китай) та їх відповідний негативний контроль (NC; Ribobio, Гуанчжоу, Китай) відповідно до інструкцій виробника з Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, США) та середовище Opti-MEM (Гібко, Каліфорнія, США). Середовище замінювали DMEM з 10% FBS після трансфекції протягом 6 год. Експерименти проводили через 24 год після трансфекції.

Аналіз репортера люциферази

Послідовність ділянки насіння дикого типу (WT) або мутантного (Mut) SCD-1 клонували у вектор люциферази psiCHECK-2 (Promega, Madison, WI, США) між сайтами XhoI та NotI. Після висівання на 96-лункову платівку клітини 293T трансфікували 0,16 мкг вектора неперекладеної області SCD-1 3 '(UTR) (WT та Mut) та порожнього вектора, а також 50 нмоль/л miR-192- 5p імітують, інгібітор 200 нмоль/л та їх відповідний NC. Живильне середовище замінювали на повний DMEM через 6 годин. Активність люциферази вимірювали за допомогою системи подвійної люциферази Promega через 48 год після трансфекції, а відносну активність люциферази розраховували як люциферазу ренілли до люциферази Firefly.

Кількісна ланцюгова реакція полімерази в режимі реального часу

Вестерн-блот-аналіз

Зразки білка 30 мкг аналізували за допомогою електрофорезу 10% додецилсульфату натрію та поліакриламідного гелю, а потім переносили на мембрани нітроцелюлози. Мембрани блокували 5% знежиреного молока в TBST протягом 2 годин при кімнатній температурі, а потім інкубували з моноклональним антитілом миші проти SCD-1 (Abcam, Кембридж, Великобританія) та мишачим моноклональним антитілом до тубуліну (Beyotime, Шанхай, Китай) протягом ночі о 4 ° C. Потім ці мембрани промивали та інкубували при кімнатній температурі з вторинним антитілом проти миші (Beyotime, Шанхай, Китай) протягом 1 години. Імунні комплекси виявляли за допомогою західного хемілюмінесцентного субстрату HRP (Millipore Corporation, Billerica, MA, США).

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± SEM. Статистичне порівняння було проведено за допомогою двостороннього t-критерію Стьюдента між двома групами та одностороннього аналізу дисперсійного тесту з подальшим аналізом Стьюдента – Ньюмена – Куельса серед декількох груп. Різниці вважали значущими на P-му тижні, у всіх щурів групи HFD розвинувся НАСГ із значним печінковим макро-везикулярним стеатозом, балонною дегенерацією та часточковим запаленням. Середня маса тіла щурів з HFD (661,7 ± 15,8 г) була вищою, ніж у контролів (566,7 ± 8,1 г, P Фігура 1A-C). 1A -C). Аналіз біохімічних показників сироватки крові на моделях тварин показав, що щури з HFD мали вищий рівень аланінтрасамінази (ALT), аспартат трансамінази (AST), а також рівень ліпопротеїдів низької щільності (LDL) і нижчий рівень ліпопротеїдів високої щільності (HDL) порівняно з контролем. групу (Р (табл. 1). 1). Результати qRT-PCR показали, що щури HFD знизили рівень miR-192-5p в печінці (0,46 рази) порівняно з контролем і що терапія ліраглутидом може скасувати зменшення miR-192-5p у печінці HFD щурів (P Рисунок 1D) . 1D). На додаток до зниженого рівня miR-192-5p у печінці, експресія білка у печінковому SCD-1 була помітно підвищена (у 3,5 рази) у щурів, яких годували HFD, і терапія ліраглутидом могла зменшити рівень SCD-1 у печінці у щурів HFD (P Малюнок 1E 1E).