Молекулярна
Ліки
Звіти

  • Журнал Головна
  • Поточне питання
  • Майбутній випуск
  • Найчитаніші
  • Найчастіше цитовані (розміри)
    • Останні два роки
    • Разом
  • Найчастіше цитовані (CrossRef)
    • Минулий рік 0
    • Разом

  • Соц.медіа
    • Минулий місяць
    • Минулий рік
    • Разом
  • Архів
  • Інформація
  • Онлайн подання
  • Інформація для авторів
  • Редагування мови
  • Інформація для рецензентів
  • Редакційна політика
  • Редакційна колегія
  • Цілі та сфера застосування
  • Абстрагування та індексування
  • Бібліографічна інформація
  • Інформація для бібліотекарів
  • Інформація для рекламодавців
  • Передруки та дозволи
  • Зверніться до редактора
  • Загальна інформація
  • Про Спандідос
  • Конференції
  • Вакансії
  • Зв'язок
  • Правила та умови
  • Автори:
    • Ян Лю
    • Чжицян Ван
    • Веньлян Сяо

  • Ця стаття згадується в:

    Анотація

    Всебічне дослідження виявило безліч мікроРНК, які аберативно виражаються в серцевій гіпертрофії, серед яких miR-26a виявляє велику експресію в нормальному серці (16). У зв’язку з цим було висунуто гіпотезу, що miR-26a може бути важливим регулятором гіпертрофії серця, і тому в цьому дослідженні проведено серію експериментів з поперечним звуженням аорти черевної порожнини (TAAC) та ангіотензином II (Ang II) індуковані кардіоміоцити (КМ), виділені із серця новонароджених щурів. Надмірне вираження та придушення miR-26a опосередковувалося його імітатором та інгібітором відповідно. Передсердний натрійуретичний фактор (ANF) та важкий ланцюг β-міозину (β-MHC) оцінювали як показники гіпертрофії серця. Крім того, дане дослідження мало на меті підтвердити, чи GATA4 є мішенню miR-26a шляхом мутації цільових сайтів у 3′-UTR GATA4. За допомогою цих експериментів дане дослідження мало на меті з’ясувати роль miR-26 та його регуляторний механізм в опосередкуванні серцевої гіпертрофії, що може забезпечити ліди для терапевтичних цілей при лікуванні серцевої гіпертрофії.

    інгібування

    Матеріали і методи

    Тварини
    Клітини
    Трансфекція клітин та аналіз репортерної функції подвійної люциферази

    Ціль-ген miR-26a прогнозували за допомогою TargetScan (www.targetscan.org). Мутант 3′-UTR GATA4 був синтезований за допомогою набору QuikChange Multi-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Дикий тип або мутант 3′-UTR GATA4 клонували в сайти рестрикції Kpn I та Bgl II нижче за течією відкритої рамки зчитування люніферази ренілли у векторі люциферази pGL3-промотору (Promega, Madison, WI, USA). СМ, культивовані в 24-лункових планшетах (1,5 × 10 5 на лунку), трансфікували імітатором miR-26a (50 нМ) або інгібітором (Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай) і котрансфікували репортером люциферази, що містить дикого типу або мутанта 3′-UTR GATA4 (200 нг) або репортерної люциферази репортерної плазміди pRL-RSV (20 нг; Promega) з використанням Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) згідно з протоколом виробника. Надмірна експресія GATA4 була досягнута шляхом трансфекції вектора T (200 нг; Promega), що містить кодуючу послідовність GATA4. Через 48 годин після трансфекції активність люциферази визначали за допомогою системи виявлення GloMax®-Multi (Promega), нормалізованої щодо активності гена люциферази Renilla.

    Імуногістохімія та імуноцитохімія

    Тканину серця щурів у групах Control та TAAC вкладали у парафін і розрізали на шматочки 4 мкм. Загалом 1 × 10 5 СМ висівали на предметне скло в 6-лункові планшети, культивували та обробляли Ang II, як описано вище. Клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 15 хв і транспарентизували 0,5% Triton X-100 протягом 20 хв. Всі предметні стекла тканин та клітин інкубували в 3% H 2 O 2 протягом 15 хв при кімнатній температурі. Клітини блокували інкубацією в козячій сироватці (Sigma-Aldrich China, Inc.) протягом 30 хв, а потім клітини інкубували з мишачим моноклональним анти-α-актиніновим антитілом (1: 1000; Abcam; кат. № ab108198 ) при 4 ° C протягом ночі, а потім кон’югованим вторинним антитілом, конусованим проти козиних пероксидаз хрону (HRP) (1: 2000; Abcam; кат. № ab7090), протягом 30 хв. Позитивні сигнали розроблялися з використанням фарбування діамінобензидином (Solarbio, Пекін, Китай), після чого клітини фарбували гематоксиліном. Слайди спостерігали під мікроскопом (MM200; Nikon, Токіо, Японія), а площа СМ розраховували за допомогою ImageJ версії 1.49 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

    Аналіз включення лейцину

    Аналіз включення лейцину проводили для відображення синтезу білка в СМ. Після обробки Ang II до клітин додавали 3 Н-мічений лейцин (1 мкКі/мл) для інкубації при 37 ° C протягом 12 годин. Згодом клітини тричі промивали холодним сольовим розчином, забуференним фосфатом, і лізували в буфері для лізису. Сигнал лейцину [3 H] виявляли шляхом рідинного сцинтиляційного підрахунку за допомогою Tri-Carb (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA).

    Кількісна ПЛР із зворотною транскрипцією (RT-qPCR)
    Вестерн-блот-аналіз

    СМ та тканини серця лізували в холодному буфері аналізу радіоімунопреципітації (RIPA) (Інститут біотехнології Бейотіме, Шанхай, Китай), а витягнуті зразки білків кількісно визначали за допомогою набору для аналізу білків Bio-Rad (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія, США ). Ідентичні кількості зразків білка відокремлювали за допомогою електрофорезу 10% додецилсульфату натрію та поліакриламідного гелю та переносили на мембрану з полівініліденфторидом (Roche). Мембрану блокували 5% знежиреного молока при кімнатній температурі протягом 2 годин, після чого проводили інкубацію із специфічним первинним антитілом проти GATA4 (1: 1000; Abcam; кат. № ab86371) при 4 ° C протягом ночі. GAPDH використовувався як внутрішнє посилання. Після триразового промивання протягом 5 хв кожного разу в забуференному трісом фізіологічному розчині з Твін (TBST) мембрану інкубували з кон'югованим HRP вторинним антитілом при кімнатній температурі протягом 2 годин і знову промивали в TBST. Згодом позитивні смуги були розроблені з використанням підсиленої хемілюмінесценції (ECL) Plus Western Blotting субстрат (Thermo Fisher Scientific, Inc.) та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення ImageJ 1.49.

    Статистичний аналіз

    Фігура 1

    miR-26a інгібує серцеву гіпертрофію на TAAC-індукованій моделі щурів. (A) Частка HW, позначена HW/BW, більша у групі TAAC. (B) Відносна площа СМ більше у групі TAAC. (C) Експресія мРНК ANF та β-MHC підвищена в групі TAAC. (D) Рівень miR-26a пригнічений у групі TAAC. * Р ANF та β-MHC-мРНК були суттєво підвищеними, при лікуванні Ang II (P 3 H] також вимірювали вміст лейцину для оцінки швидкості синтезу білка в СМ, оскільки прискорений синтез білка є ще однією характеристикою серцевої гіпертрофії. Ці результати продемонстрували що синтез білка був посилений у СМ, оброблених Ang II, хоча це посилення було зменшене надмірною експресією miR-26a.У сукупності ці результати показали, що CM, індуковані Ang II, виявляли серцеві гіпертрофічні властивості, такі як більша площа СМ, ​​прискорений синтез білка і сприяння експресії генів, пов'язаних з гіпертрофією серця. Однак надмірна експресія miR-26a змогла суттєво пригнічувати ці ефекти, маючи на увазі, що вона відіграє певну роль у пригніченні гіпертрофії серця в культивованих СМ.

    Малюнок 2

    miR-26a пригнічує серцеву гіпертрофію в індукованих Ang II СМ. (A) експресія miR-26a інгібується в СМ, оброблених Ang II. (B) Площа СМ більша в клітинах, оброблених Ang II, але зменшується при надмірній експресії miR-26a. (C) Експресія мРНК ANF та β-MHC регулюється в СМ, оброблених Ang II, і знижується шляхом надмірної експресії miR-26a. (D) Синтез білка, зазначений включенням [3H] лейцину, прискорюється в клітинах, оброблених Ang II, і пригнічується надмірною експресією miR-26a. ** P GATA4 передбачався цільовим геном miR-26a за допомогою TargetScan (рис. 3А). Тому було проаналізовано вплив miR-26a на експресію GATA4 за допомогою імітатора miR-26a та інгібітора. Результати RT-qPCR продемонстрували, що експресія мРНК GATA4 інгібується при надмірній експресії miR-26a (P GATA4 був цільовим геном miR-26a.

    Малюнок 3

    GATA4 компенсує супресивну роль miR-26a в гіпертрофії серця

    Малюнок 4

    Підводячи підсумок, у цьому дослідженні визначена захисна роль miR-26a шляхом придушення GATA4 та, в свою чергу, подальших факторів, що впливають на серцеву гіпертрофію. Ці результати потенційно корисні з точки зору можливого використання miR-26a та терапевтичних цілей, таких як GATA4, для лікування серцевої гіпертрофії.

    Список літератури

    Senthil V, Chen SN, Tsybouleva N, Halder T, Nagueh SF, Willerson JT, Roberts R та Marian AJ: Запобігання гіпертрофії серця аторвастатином у трансгенній кролячій моделі гіпертрофічної кардіоміопатії людини. Circ Res. 97: 285–292. 2005. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Okere IC, Young ME, McElfresh TA, Chess DJ, Sharov VG, Sabbah HN, Hoit BD, Ernsberger P, Chandler MP and Stanley WC: Дієта з низьким вмістом вуглеводів/жиру послаблює гіпертрофію серця, перебудову та зміну експресії генів при гіпертонії. Гіпертонія. 48: 1116–1123. 2006. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Doyle B, Sorajja P, Hynes B, Kumar AH, Araoz PA, Stalboerger PG, Miller D, Reed C, Schmeckpeper J, Wang S, et al. секреція кардіотрофічних факторів, включаючи TGFbeta1. Стовбурові клітини розробник 17: 941–951. 2008. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Тижні KL та McMullen JR: Серце спортсмена проти серця, що не працює: Чи може сигналізація пояснити два різні результати? Фізіологія (Bethesda). 26: 97–105. 2011. Переглянути статтю: Google Scholar

    Kodama H, Fukuda K, Pan J, Sano M, Takahashi T, Kato T, Makino S, Manabe T, Murata M і Ogawa S: Значення каскаду ERK порівняно з JAK/STAT та PI3-K при серцевій гіпертрофії, опосередкованій gp130 . Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279: H1635 – H1644. 2000.PubMed/NCBI

    Lezoualc'h F, Metrich M, Hmitou I, Duquesnes N та Morel E: Малі GTP-зв'язуючі білки та їх регулятори при серцевій гіпертрофії. J Mol Cell Cell Cardiol. 44: 623–632. 2008. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Pan J, Singh US, Takahashi T, Oka Y, Palm-Leis A, Herbelin BS та Baker KM: PKC опосередковує циклічну гіпертрофію серця, спричинену розтягуванням, через GTPases сімейства Rho та мітоген-активовані протеїнкінази в кардіоміоцитах. J клітинний фізіол. 202: 536–553. 2005. Переглянути статтю: Google Scholar

    Yue H, Li W, Desnoyer R та Karnik SS: Роль ядерного нефосфорильованого STAT3 в індукованій серцевою гіпертрофією рецептора ангіотензину II типу. Кардіоваск Res. 85: 90–99. 2010. Переглянути статтю: Google Scholar

    Гладка М.М., да Коста Мартінс П.А. та Де Віндт Л.Ж .: Невеликі зміни можуть мати велике значення - регуляція мікроРНК серцевої гіпертрофії. J Mol Cell Cell Cardiol. 52: 74–82. 2012. Переглянути статтю: Google Scholar

    Callis TE, Pandya K, Seok HY, Tang RH, Tatsuguchi M, Huang ZP, Chen JF, Deng Z, Gunn B, Shumate J та ін: MicroRNA-208a є регулятором серцевої гіпертрофії та провідності у мишей. J Clin Invest. 119: 2772–2786. 2009. Переглянути статтю: Google Scholar:

    Wang K, Lin ZQ, Long B, Li JH, Zhou J і Li PF: Гіпертрофія серця позитивно регулюється мікроРНК miR-23a. J Biol Chem. 287: 589–599. 2012. Переглянути статтю: Google Scholar:

    Huang ZP, Chen J, Seok HY, Zhang Z, Kataoka M, Hu X та Wang DZ: MicroRNA-22 регулює серцеву гіпертрофію та реконструкцію у відповідь на стрес. Circ Res. 112: 1234–1243. 2013. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Care A, Catalucci D, Felicetti F, Bonci D, Addario A, Gallo P, Bang ML, Segnalini P, Gu Y, Dalton ND та ін: MicroRNA-133 контролює серцеву гіпертрофію. Nat Med. 13: 613–618. 2007. Переглянути статтю: Google Scholar

    Li Q, Song XW, Zou J, Wang GK, Kremneva E, Li XQ, Zhu N, Sun T, Lappalainen P, Yuan WJ, et al: Ослаблення мікроРНК-1 знижує цитоскелет регуляторного білка твінфілін-1, щоб спровокувати гіпертрофію серця . J Cell Sci. 123: 2444–2452. 2010. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Wei L, Yuan M, Zhou R, Bai Q, Zhang W, Zhang M, Huang Y і Shi L: MicroRNA-101 пригнічує гіпертрофію серця щурів, націлюючи на Rab1a. J Cardiovasc Pharmacol. 65: 357–363. 2015. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Ченг І, Джи Р, Юе Дж, Ян Дж, Лю Х, Чень Х, Дін БД та Чжан С: МікроРНК похибки виражаються в гіпертрофічному серці: чи відіграють вони роль у серцевій гіпертрофії? Am J Pathol. 170: 1831–1840. 2007. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Sayed D, Hong C, Chen IY, Lypowy J та Abdellatif M: МікроРНК відіграють важливу роль у розвитку серцевої гіпертрофії. Circ Res. 100: 416–424. 2007. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Gao J та Li QG: Роль miR-26 у пухлинах та нормальних тканинах (огляд). Онкол Летт. 2: 1019–1023. 2011 рік.

    Han M, Yang Z, Sayed D, He M, Gao S, Lin L, Yoon S та Abdellatif M: Експресія GATA4 в основному регулюється за допомогою miR-26b-залежного механізму посттранскрипції під час серцевої гіпертрофії. Кардіоваск Res. 93: 645–654. 2012. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Zhang ZH, Li J, Li BR, Luo CF, Dong Q, Zhao LN, Zhong Y, Chen WY, Chen MS і Liu SM: MicroRNA-26 була зменшена в моделі серцевої гіпертрофії щурів і може бути перспективною терапевтичною мішенню. J Cardiovasc Pharmacol. 62: 312–319. 2013. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Парментьє JH, Павічевич Z та Малік KU: Ang II стимулює фосфоліпазу D через активацію PKCzeta у VSMC: Наслідки адгезії, поширення та гіпертрофії. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290: H46 – H54. 2006. Переглянути статтю: Google Scholar

    Li R, Xiao J, Qing X, Xing J, Xia Y, Qi J, Liu X, Zhang S, Sheng X, Zhang X і Ji X: Sp1 опосередковує терапевтичну роль MiR-7a/b в індукованій ангіотензином II серцевій діяльності фіброз через механізм, що включає шляхи TGF-β та MAPK у серцевих фібробластах. PLoS Один. 10: e01255132015. Переглянути статтю: Google Scholar

    Garcia R, Thibault G і Cantin M: Співвідношення між гіпертрофією серця та рівнем натрійуретичного фактора передсердь у плазмі на неспонтанних моделях гіпертонії у щурів. Biochem Biophys Res Commun. 145: 532–541. 1987. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Haddad F, Qin AX, Bodell PW, Zhang LY, Guo H, Giger JM та Baldwin KM: Регулювання антисенсорної експресії РНК під час перемикання серцевого гена MHC у відповідь на перевантаження тиском. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290: H2351 – H2361. 2006. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Hu X, Li T, Zhang C, Liu Y, Xu M, Wang W, Jia Z, Ma K, Zhang Y та Zhou C: GATA4 регулює експресію ANF синергічно з Sp1 в моделі серцевої гіпертрофії. J Cell Mol Med. 15: 1865–1877. 2011. Переглянути статтю: Google Scholar

    Charron F, Paradis P, Bronchain O, Nemer G та Nemer M: Кооперативна взаємодія між GATA-4 і GATA-6 регулює експресію генів міокарда. Mol Cell Biol. 19: 4355–4365. 1999. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Li YL, Huang CC, Chang CC, Chou CY, Lin SY, Wang IK, Hsieh DJ, Jong GP, Huang CY і Wang CM: Гіперфосфатна індукована гіпертрофія міокарда через сигнальний шлях GATA-4/NFAT-3 послаблюється ERK лікування інгібітором. Cardiorenal Med. 5: 79–88. 2015. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Xiang F, Sakata Y, Cui L, Youngblood JM, Nakagami H, Liao JK, Liao R and Chin MT: фактор транскрипції CHF1/Hey2 пригнічує серцеву гіпертрофію через інгібуючу взаємодію з GATA4. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290: H1997 – H2006. 2006. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Kwon DH, Eom GH, Kee HJ, Nam YS, Cho YK, Kim DK, Koo JY, Kim HS, Nam KI, Kim KK та ін: Естроген-пов'язана рецепторна гамма викликає гіпертрофію серця шляхом активації GATA4. J Mol Cell Cell Cardiol. 65: 88–97. 2013. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Liang Q, Wiese RJ, Bueno OF, Dai YS, Markham BE та Molkentin JD: Фактор транскрипції GATA4 активується позаклітинним регульованим сигналом кіназою 1- та 2-опосередкованим фосфорилюванням серину 105 в кардіоміоцитах. Mol Cell Biol. 21: 7460–7469. 2001. Переглянути статтю: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Пов’язані статті

    Вересень-2016
    Том 14 Випуск 3

    Друк ISSN: 1791-2997
    Інтернет ISSN: 1791-3004