Межі в синаптичній нейронауці

Редаговано
Карлос Б. Дуарте

Університет Коїмбри, Португалія

Переглянуто
Курт Готтман

Дюссельдорфський університет імені Генріха Гейне, Німеччина

Шуя Фукай

Токійський університет, Японія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

диференціації

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Джавад Мовафагіанський центр здоров'я мозку, кафедра психіатрії, Університет Британської Колумбії, Ванкувер, Британська Колумбія, Канада
  • 2 Центр наук про здоров'я, Інститут перспективної медицини Клейсена, Університет Манітоби, Вінніпег, МБ, Канада
  • 3 Кафедра фізіології та патофізіології, Факультет наук про здоров'я Раді, Університет Манітоби, Вінніпег, МБ, Канада
  • 4 Дослідницький інститут дитячої лікарні в Манітобі (CHRIM), Вінніпег, МБ, Канада
  • 5 Кафедра клітинних та фізіологічних наук, медичний факультет, Інститут наук про життя, Університет Британської Колумбії, Ванкувер, Британська Колумбія, Канада

Вступ

Ключовий ранній крок у формуванні нового синапсу включає зв'язок між синаптичними організуючими білками, експресованими на аксоні одного нейрона, і дендритом іншого, що викликає кластеризацію внутрішньоклітинних синаптичних білків в обох нейронах. Представлення одного синаптичного організуючого білка, експресованого на поверхні ненейрональної клітини, є достатнім, щоб викликати локальне скупчення пресинаптичних або постсинаптичних механізмів. Прикладом цього є перша відкрита і найбільш відома пара синаптичних організуючих білків, постсинаптичних нейролігінів (Scheiffele et al., 2000) та пресинаптичних нейрексинів (Graf et al., 2004). На додаток до нейролігінів та нейрексинів, було описано безліч інших організуючих білків із подібною синаптогенною активністю (Südhof, 2018). Сюди входять пресинаптично експресована LAR, білкова тирозинфосфатаза σ (PTPσ) та PTPδ, які разом утворюють сімейство LAR-RPTP та взаємодіють з постсинаптичним NGL-3 (Woo et al., 2009), TrkC (Takahashi et al., 2011), Slitrk1-6 (Takahashi et al., 2012; Um et al., 2014), Il1RAPL1 (Yoshida et al., 2011), IL1RAcP (Yoshida et al., 2012), SALM3 і SALM5 (Mah et al., 2010; Li et al., 2015).

Механізм, за допомогою якого синаптичні організуючі білки сигналізують про утворення зароджується синапсу, повинен включати не лише адгезію. У випадку з нейрексином, рекрутування внутрішньоклітинних білків може відбуватися принаймні за певних обставин без присутності внутрішньоклітинної області нейрексину (ICR; Gokce and Südhof, 2013), імовірно, через неідентифікований ко-рецептор. Схоже, це не справедливо для LAR-RPTP, оскільки версія PTPσ, у якій відсутня його ICR, виступала як домінантно-негативний супресор синаптогенезу (Takahashi et al., 2011). Однак механізм, за допомогою якого ці білки здійснюють свою дію, включаючи залучення внутрішньоклітинних взаємодіючих білків та/або ко-рецепторів, недостатньо вивчений.

LAR-RPTP складаються з позаклітинних доменів Ig та FNIII, які опосередковують зв'язування з постсинаптичними лігандами NGL-3, TrkC, Slitrks, IL1RAPL1, IL1RAcP та SALM (Takahashi and Craig, 2013). Домен LAR-RPTP Ig1 також пов'язує хондроїтин сульфат та гепаран сульфат (HS), взаємодії, що регулюють ріст аксонів (Arickscu et al., 2002; Shen et al., 2009). В контексті синаптогенезу HS конкурує з TrkC за зв'язування PTPσ (Coles et al., 2014), але HS може опосередковувати утворення додаткових синаптогенних комплексів, як пропонується для комплексу PTPσ-glypican-4-LRRTM4 (Ko et al., 2015 ). Іншою основною родиною пресинаптичних організаторів, нейрексинами, є HSPG (Zhang et al., 2018). Поки незрозуміло, чи може взаємодія LAR-RPTP, опосередкована HS, з нейрексинами або іншими аксональними ко-рецепторами сприяти синаптогенній функції.

Після єдиного трансмембранного домену LAR-RPTP мають невеликий клиновий домен, за яким слідують два домени, подібні до фосфатази, що називаються D1 і D2, з яких каталітично активним є лише D1 (Streuli et al., 1990; Takahashi and Craig, 2013). Відомо кілька ферментативних субстратів LAR-RPTP, включаючи p250GAP (Chagnon et al., 2010), β-катенін (Müller et al., 1999; Dunah et al., 2005) та N-кадгерин (Siu et al., 2007), які потенційно можуть опосередковувати їх синаптогенний ефект. Домен D2 зв'язується з білками лісу сімейства liprin-α (Serra-Pagès et al., 1995), тріо GEF/кіназа (Debant et al., 1996), а також з CASK-взаємодіючими білками caskin1 і caskin2 ( Венг та ін., 2011).

Тут ми використовували стратегію молекулярної заміни, при якій одна або кілька міжмолекулярних взаємодій порушувались шляхом делеції домену або точкового мутагенезу, щоб надати розуміння механізму, за допомогою якого PTPσ сигналізує про утворення зароджується синапсу. Ми виявили, що здатність PTPσ опосередковувати індукцію нових пресинаптичних ділянок через своїх канонічних транссинаптичних партнерів не залежить від його здатності дефосфорилювати мішені або зв'язувати HSPG, але він вимагає місця зв'язування для ліпріну-α. Наші результати також свідчать про те, що, на відміну від попередніх звітів, зв'язування між PTPσ та ліприном-α включає як домени D1, так і D2 PTPσ.

Матеріали і методи

Конструкції ДНК та вірусні вектори

Вектор pFB-shPTP, використовуваний для упаковки AAV6-shPTP, був створений на основі L315-shCtrlx4 (Gokce and Südhof, 2013), pFB-AAV-GFP-4xshRNA (Zhang et al., 2018) та послідовностей shRNA проти PTPσ (5 ′ -GGCATCATGGGTAGTGATT-3 ′), PTPδ [5′-GTGCCGGCTAGAAACTTGT-3 ′ (Dunah et al., 2005)] та LAR [5′-GGCCTACATAGCTACACAG-3 ′ (Mander et al., 2005)]. Ця плазміда була упакована в AAV6 компанією Virovek. AAV6-GFP-4xshRNA, названа тут shCtrl, була описана раніше (Zhang et al., 2018).

Раніше були описані наступні конструкції: HA-CD4, pLL-CFP (стійкий до shCtrl; Zhang et al., 2018), HA-TrkC та TrkC-CFP (обидві некаталітичні форми; Takahashi et al., 2011). HA-NGL-3 був створений на основі NGL-3-CFP (Siddiqui et al., 2013) шляхом вставки мітки HA (YPYDVPDYA) після сигнального пептиду та видалення С-кінця CFP, а V5-CD4 був створений з YFP -CD4 (Такахаші та ін., 2011), замінивши мітку YFP на V5 (GKPIPNPLLGLDST) після сигнального пептиду.

pLL3.7-hSyn-V5-PTPσ дикого типу (WT), делеція ICR (ΔICR, відсутні амінокислоти 974–1530, KLSQ… HYAT), C1142S, 4K4A, делеція D1 (ΔD1, відсутні амінокислоти 993–1232, SNLE … EAVG), делеція D2 (ΔD2, відсутні амінокислоти 1251–1523, AQVE… EYLG), D2D2 (амінокислоти 993–1232, замінені амінокислотами 1251–1523), PPLL, QFG та EGFID були створені на основі C1-YFP -миша PTPσ з чотирма доменами FNIII і не маючи сплайс-вставок meA та meB (Takahashi et al., 2011). Мітка V5 була вставлена ​​безпосередньо після видалення сигнального пептиду та YFP, а конструкція WT (яка використовувалась як шаблон для побудови всіх мутантів) стала стійкою до рРНК шляхом мутації послідовності GGCATCATGGGTAGTGATT в GGaATaATGGGaAGcGATT.

C1-myc-trio (Terry-Lorenzo et al., 2016) був ласкавим подарунком доктора Крейга Гарнера (Німецький центр нейродегенеративних захворювань, Бонн, Німеччина) і містить послідовність кДНК людського тріо. КДНК миші caskin1 (номер приєднання BC060720) отримано з Open Biosystems. Невелика частина 5 ′ кінця кДНК відсутня і була відновлена ​​за допомогою ПЛР.

CMV-HA-ліприн-α2, що містить мишачий ліпрін-α2, був своєрідним подарунком доктора Сюзан Шох (Інститут невропатології, Бонн, Німеччина), що містить ген ліпрін-α2 миші. Ми мутували послідовність GGGGCTGATCCACCGGAGTTT на GGaGCcGATCCtCCaGAaTTT для того, щоб зробити послідовність стійкою до shRNA (не використовується в цій роботі) без зміни амінокислотної послідовності. З отриманої плазміди ми перенесли відкриту рамку зчитування у вектор pBA, який містить промотор β-актину курки CAG і був ласкавим подарунком від д-ра Гері Банкера (Орегонський університет охорони здоров’я та наук, Портленд, ОР, США), і замінив N-кінцевий тег HA з міткою myc (EQKLISEEDL) для генерування pBA-myc-liprin-α2.

Злиття з C-кінцевим фрагментом F3 дигідрофолатредуктази (DHFR) проводили на основі p41-HPH-TEF-SspBYGMF-лінкера-DHFR-F3 (Tarassov et al., 2008). Послідовності PTPσ, ліпрін-α2, каскін1 та тріо субклоновані або повністю, або в усіченій формі з описаних вище плазмід, так що вони злиті на своїх С-кінцях через короткий лінкер до фрагмента F3. PTPσ ICR складався з амінокислот 974–1530 (KLSQ… HYAT), ліпрін-α2 SAM складався з амінокислот 877–1192 (KDRR… SDDK), caskin1 SAM складався з амінокислот 344–636 (AIVK… MAIE) та тріо IgPSK складався з амінокислот 2237–3062 (NQRN… LPRV). Злиття з N-кінцевим фрагментом F1-2 DHFR клонували у вектор p413 (Mumberg et al., 1995). Касета, що містить фрагмент DHFR F1–2 і термінатор Adh1 з pAG25-F1–2 (Тарассов та ін., 2008), була злита з С-кінцем PTPσ повної довжини (FL) або ICR під контролем TEF промоутер. PTPσ-FL-DHFR як F1–2, так і F3 містили N-кінцеву мітку V5. NgCAM, який був ласкавим подарунком від доктора Пітера Сондереггера (Університет Цюріха, Цюріх, Швейцарія), та YFP були окремо злиті з F1–2 та F3 як елементи контролю. Точкові мутації були введені у злиття PTPσ FL або ICR DHFR F1–2, а також у злиття PTPσ FL DHFR F3 у випадку мутанта PPLL (Hofmeyer and Treisman, 2009).

Культура нейронів, трансфекція та трансформація AAV

Це дослідження було проведено відповідно до рекомендацій Канадської ради з догляду за тваринами. Протокол був схвалений Комітетом з догляду за тваринами Університету Британської Колумбії.

Первинні ембріональні нейрони гіпокампа щурів 18-го дня (E18) культивували, по суті, згідно з методом, описаним у Kaech and Banker (2006). Для експресії конструкцій ДНК використовували систему нуклеофекторів AMAXA (Lonza) для доставки відповідної кількості плазміди (2–4 мкг на конструкцію) до 1–2 мільйонів свіжодисоційованих клітин. Клітини висівали на покривні покриття з полі-L-лізину при початковій щільності приблизно 700 000–900 000 для трансфікованих нейронів або 500 000 для нетрансфікованих нейронів на 6-сантиметрову чашку. Нейрони підтримували гліальним живильним шаром, а цитозин арабінозид (5 мкМ) додавали при DIV 2 для запобігання надмірному зростанню глії. DL-2-аміно-5-фосфоновалеріанова кислота (APV, 100 мкМ) була додана, починаючи з DIV 5, з метою обмеження екситотоксичності та поліпшення виживання нейронів.

Доставка AAV була здійснена шляхом інкубації нейронів DIV 6 лицьовою стороною догори в 12-лункових планшетах, кожна лунка містить 700 мкл кондиціонованого глію середовища з 5 × 10 9 вірусними геномами (vg) відповідної вірусної конструкції. Кондиціоновані середовища збирали або з власного посуду нейронів, або з подібних посудів і центрифугували протягом 5 хв при 1500 × g перед використанням. APV додавали у концентрації 100 мкМ. Нейрони інкубували у вірусвмісному розчині протягом 4 год, а потім переносили назад до домашніх страв.

Кількісна ПЛР у реальному часі (RT-qPCR)

RT-qPCR проводили для підтвердження потрійного збиття PTPσ, PTPδ та LAR за допомогою AAV6-shPTP. Нейрони обробляли AAV, несучи shCtrl або shPTP, як зазначено вище, збирали на DIV 16 в холодному PBS, а потім лізували в реагенті TRIzol (Invitrogen). Вилучення РНК з лізатів проводили негайно, використовуючи міні-комплект РНК PureLink (Thermo Fisher Scientific). Елімінацію геномної ДНК та ретро-транскрипцію до кДНК проводили за допомогою SuperScript IV Vilo Master Mix з ферментом ezDNase (Thermo Fisher Scientific). SYBRGreen qPCR (PowerUp TM SYBR Green Master Mix, Thermo Fisher Scientific) проводили, використовуючи отриману кДНК, з гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназою (GAPDH) та β-актином (Actb) в якості еталонних генів. Використовувані грунтовки наведені в таблиці нижче, і їх ефективність оцінювалась від 0,87 до 1,05. Усі значення кількісного циклу (Cq) були виявлені до завершення 38-го циклу.

Список праймерів, що використовуються в кількісних аналізах RT-PCR.

Підтвердження нокдауну Вестерн-блот

Нейрони обробляли AAV, що несли shCtrl або shPTP, як зазначено вище, і збирали для вестерн-блот при DIV 17–18 із застосуванням комплексоліоліту-48 (50 мкл/покривне скло, логофарм). Були визначені концентрації білка, і в рівних кількостях застосовували 10% гелі SDS-поліакриламіду. Білки блотували за допомогою мембран Immobilon P (Millipore). Мембрани блокували, використовуючи 5% знежиреного молока у солі, забуференному Тріс, з 0,001% Твін-20 та інкубуючи у розчині антитіл. Первинними антитілами, що використовувались, були анти-PTPσ (миша, 17G7.2, MM-0020, Medimabs) та анти-β-актин (кролик, 1: 5000, ab8227, Abcam). Вторинними антитілами були козячий анти-мишачий або козячий анти-кролячий кон'югат HRP від ​​Southern Biotech. Виявлення проводили з використанням підвісного хемілюмінесцентного субстрату Immobilon (Millipore).

Аналіз кокультури

Клітини COS підтримували в модифікованому Дульбекко середовищі Ігл (DMEM) з 10% бичачої сироватки (BGS). Коли нейрони досягли віку DIV 12, майже злиті клітини COS збирали з використанням 0,25% трипсину-ЕДТА і висівали в 12-лункові планшети, а потім трансфікували наступного дня в

85% злиття з використанням поліетиленіміну (Boussif et al., 1995) з 1 мкг плазмідної ДНК, що кодує мічену форму або постсинаптичного організуючого білка, або CD4 як несинаптогенного контролю. На наступний день після трансфекції, коли нейрони знаходились на рівні DIV 13, клітини COS збирали знову, як і раніше, двічі промивали DMEM з 10% BGS, ресуспендували в гліальних кондиціонованих середовищах (обробляли, як зазначено вище, на вірусну інфекцію) і висівали на щільність

20000 клітин на покривний склінець на нейронах. Кокультурам дозволялося інкубувати протягом 18–24 год до фіксації та фарбування.

Культури клітин HEK та аналіз кластеризації

Технічне обслуговування, збір та трансфекція клітин HEK 293 (HEK) проводили так само, як і для клітин COS, за винятком того, що використовувана концентрація трипсину-ЕДТА становила 0,05%. До трансфекції клітини висівали в 12-лункові планшети на покривних стеклах, покритих полі-D-лізином (PDL). Кластерний аналіз проводили шляхом трансфекції клітин HEK сумішшю 0,2 мкг pBA-myc-ліприну-α2, 0,6 мкг pLL-V5-PTPσ WT або мутанта та 0,2 мкг pLL CFP. Контрольні покривні стекла замінили або ліпрін-α2, або плазміду PTPσ рівною кількістю додаткової плазміди pLL CFP, так що загальна кількість ДНК завжди становила 1 мкг.

Імуноцитохімія та візуалізація

Фарбування живої поверхні як для клітин HEK (рис. 7), так і для кокультур (рис. 2–4) проводили шляхом інкубації покривних стекол лицьовою стороною вгору в розчині антитіл протягом 30 хв на крижаному блоці в 37 ° C, зволоженому інкубаторі 5% CO2. Розчин антитіл виготовляли зі свіжими нейробазальними середовищами. APV додавали у концентрації 100 мкМ для експериментів із залученням нейронів. Покривні шафи тричі промивали нейробазальним середовищем перед фіксацією.

Цитування: Bomkamp C, Padmanabhan N, Karimi B, Ge Y, Chao JT, Loewen CJR, Siddiqui TJ і Craig AM (2019) Механізми пресинаптичної диференціації, опосередкованої PTPσ. Спереду. Синаптичні нейроски. 11:17. doi: 10.3389/fnsyn.2019.00017

Отримано: 12 березня 2019 р .; Прийнято: 06 травня 2019 р .;
Опубліковано: 22 травня 2019 р.

Карлос Б. Дуарте, Університет Коїмбри, Португалія

Шуя Фукай, Токійський університет, Японія
Курт Готманн, Університет Генріха Гейне, Дюссельдорф, Німеччина