Кріоконсервація тканини пуповини: короткий огляд

Анотація

У цьому огляді ми представляємо поточні докази можливості кріоконсервації тканини пуповини для подальшого клінічного використання. Висвітлено протоколи для отримання судин, отриманих з пуповини, трансплантатів на основі желе Уартона, мультипотентних стромальних клітин та інших біомедичних продуктів із кріоконсервованих пуповин та обговорено їх перспективне клінічне застосування. Огляд недавньої літератури свідчить, що найближчим часом слід очікувати великого попиту на кріоконсервацію тканин пуповини.

Передумови

У 1974 р. Повідомлялося, що пуповинна кров (UCB) є джерелом гемопоетичних стовбурових і клітин-попередників [1], а в 1988 р. Була проведена перша трансплантація кріоконсервованого UCB немовляті з анемією Фанконі, спадковою хворобою кісткового мозку. у Франції [2]. Протягом наступних 30 років було опубліковано численні дослідження, що демонструють регенеративний потенціал певних популяцій клітин, похідних від UCB, і створена глобальна мережа державних та приватних біобанків UCB [3, 4].

Протягом багатьох років тверді тканини пуповини (UC) трактувались як безцінні медичні відходи. Проте останнє десятиліття відзначилося інтенсивним розвитком біомедичних продуктів на основі тканин UC - наприклад, мезенхімальних стовбурових клітин, отриманих від UC, які можна отримати із загального UC або його розсічених відділів (периваскулярних, міжсудинних, субамніотичні зони желе Уортона та субендотеліальний шар судин). Завдяки своєму високому проліферативному потенціалу, стійкості до каріотипу та фенотипу, пластичності диференціації, паракринної активності та імуномодулюючим властивостям, отримані від UC МСК можуть претендувати на титул нового «золотого стандарту», витісняючи відомі MSC з кісткового мозку [5,6, 7]. Іншими прикладами біомедичних препаратів, одержуваних з UC, є децелюляризовані судини UC, що використовуються як трансплантати для судинної хірургії [8,9,10], та позаклітинний матрикс, отриманий желе Уартона для загоєння ран [11].

Основним недоліком UC як тканинного джерела є його швидкоплинність: він доступний лише протягом короткого періоду відразу після пологів. Ефективне вирішення цієї проблеми може бути забезпечено ретельним кріоконсервуванням з усіма зусиллями, спрямовані на захист корисних компонентів (клітини, стромальні матрикси, спеціалізовані тканини) під час зберігання. Цей короткий огляд представляє поточні дані про можливості кріоконсервації тканин UC, які дозволять використовувати його конкретні компоненти в клітинній терапії та регенеративній медицині.

Кріоконсервація судин, що походять від UC

Хірургічна реконструкція дрібних судин передбачає аутологічну трансплантацію як золотий стандарт, але це не завжди доступно [9]. Децелюляризовані пупкові судини відповідного діаметру та значної довжини без гілок представляють собою придатний матеріал для судинних протезів [8,9,10, 12,13,14,15]. Це робить ефективне кріоконсервування судин, похідних UC, надзвичайно важливим для судинної хірургії. Експерименти показують, що, хоча кріоконсервація судин UC суттєво впливає на подальшу ефективність децеллюляризації (що може бути пов’язано з конденсацією позаклітинного матриксу під час заморожування), вона не впливає на їх механічні властивості, такі як жорсткість, тиск на розрив та міцність утримання швів [12 ].

Протоколи кріоконсервації судин UC як біоматеріалу для алогенної трансплантації не означають збереження клітинного компонента. З цієї причини кріоконсервуюче середовище складається із сольового розчину без кріопротекторів. Застосовується при перевищенні обсягу> 20 обсягу свіжого матеріалу при швидкості охолодження 1 ° С/хв, з подальшим зберіганням при - 20 ° С [12]. У разі кріоконсервації UC кровоносних судин для аутологічної трансплантації має сенс збереження живих клітин у стінках судин. Однак відповідних досліджень виживання клітин під час кріосховища судин UC кріопротекторами не проводилось [15]. У той же час, можлива корисність каркасів, отриманих з UC, не обмежується судинною хірургією, але може бути розширена на варіанти тканинної інженерії для нерва [16], тканин пародонта [17] та м'язово-скелетних м'яких тканин [18] регенерація.

Кріоконсервація желе Уортона

Строма UC містить унікальну желатинову речовину, якої не вистачає в організмі людини після народження. Його називають желе Уортона (WJ) на честь Томаса Уортона (1614–1673), англійського лікаря та анатома. WJ захищає судини (дві пупкові артерії та одну пупкову вену) від злипання, а також забезпечує гнучкість канатика. Він є багатим резервуаром факторів росту і містить значну кількість компонентів позаклітинного матриксу, таких як колаген (типи I, III, IV та V), гіалуронова кислота та кілька сульфатованих глікозаміногліканів [5]. Таке привабливе поєднання біомеханічних та біохімічних характеристик робить WJ важливим матеріалом-кандидатом для медичного застосування. Наприклад, було показано, що біоміметичний губчастий каркас, виготовлений із децелюляризованого ВЖ за допомогою ліофільно-сушильної техніки, покращує прикріплення, проникнення та ріст фібробластів та пришвидшує процеси загоєння ран [11].

Децелюляризовані алотрансплантати регулярно застосовуються в клінічній практиці, особливо в офтальмології та лікуванні ран [19]. Один з найпоширеніших алотрансплантатів заснований на амніотичній мембрані, яка складається з одношарового простого епітелію з товстою базальною мембраною та основної аваскулярної стромальної області. Цей трансплантат отримують зневодненням або, як варіант, заморожуванням, що краще захищає архітектуру тканини та біологічно активні молекули позаклітинного матриксу [19]. Матеріал аллотрансплантата подібної структури на основі ВЖ з кріоконсервованих UC був представлений в 2014 р. Вміст високомолекулярної гіалуронової кислоти (яка, як вважають, є ключовою ізоформою гіалуронової кислоти, відповідальної за терапевтичні властивості) після відтавання, як повідомляється, вище WJ, ніж у навколоплідних оболонках. Більше того, екстракти тканини UC, але не амніотичної мембрани, сприяють експресії протизапального цитокіну IL-10 та зменшенню експресії прозапального цитокіна IL-12 у клітинній лінії макрофагів RAW264.7. Цей результат вказує на те, що алотрансплантати UC мають певні переваги [19].

Як і у випадку з судинною тканиною, кріоконсервація UC для отримання матриць WJ не означає збереження клітинного компонента. З цієї причини свіжа тканина просто охолоджується до - 80 ° С без кріопротекторів [19]. Трансплантати, отримані на основі кріоконсервованої ВЖ, вже довели свою ефективність у лікуванні спини біфіди [20], складних виразок нижніх кінцівок з відкритими кістками, сухожиллями, м’язами та/або суглобовою капсулою, а також множинних супутніх захворювань, включаючи діабет, ішемія та основний остеомієліт [21,22,23].

Кріоконсервація клітинного компонента UC

Початок вагітності спермою, яка недовго зберігалася на сухому льоді, вперше було зроблено в 1953 р. Подальше введення рідкого азоту для тривалого кріосховища сперми на початку 1960-х суттєво сприяло ефективності підходу [24 ]. Сучасні кріотехнології дозволяють довго зберігати клітини як у суспензіях, так і в межах цілих фрагментів тканин (наприклад, цільної жирової тканини [25, 26], тканини фолікулів зубів [27], фрагментів кісткового мозку [28], яєчка [29] та яєчників [30] тканини), з яких клітини можна успішно виділити після розморожування. У порівнянні із зберіганням ізольованих клітин зберігання необроблених тканин має ряд переваг: мінімізація витрат часу, праці та матеріальних витрат; зберігання клітин у їх природному середовищі; майбутні можливості ізоляції та розширення клітин відповідно до поки невідомих майбутніх стандартів.

Повномасштабні експериментальні дослідження кріоконсервації тканин UC розпочалися близько 10 років тому. Кілька типів клітин UC, включаючи епітеліальні та ендотеліальні клітини, є цінними для регенеративної медицини та тканинної інженерії та можуть культивуватися [31,32,33]. Зовсім недавно було повідомлено про ефективний метод кріоконсервації ендотеліальних клітин пуповинної вени (HUVEC) [34]; що важливо, етап культивування та розширення клітин перед передачею зразків у біобанк у цій процедурі опущений. Коротко кажучи, первинні ендотеліальні гранули, які виділяють з UC ферментативним травленням, заморожують і поміщають у морозильну камеру для рідкого азоту для тривалого зберігання з наступним швидким розморожуванням при + 37 ° C. За цим протоколом з 17 первинних ендотеліальних гранул було успішно отримано 14 життєздатних культур HUVEC, що становить 82% успіху. Автори вважають такий підхід корисним для підвищення ефективності та логістики біобанкінгу, особливо при обробці великих колекцій зразків ендотелію [34].

Однак більшість таких досліджень переважно зосереджені на виділенні MSC з кріоконсервованої UC-тканини. Важливо зазначити, що припускають, що терапевтичний потенціал МСК суттєво зменшується під час кріозберігання (так званий "ефект кріо оглушення"), що пояснює численні невдачі клінічних випробувань із використанням клітинних трансплантатів відразу після розморожування [35]. У зв'язку з цим кріоконсервація цілої тканини UC для подальшого виділення та розширення MSC для експериментальних або клінічних цілей являє собою стратегію вибору.

Піонерські дослідження в цій галузі не увінчалися успіхом, оскільки з зразків WJ, кріоконсервованих протягом 1 тижня, 1 місяця або 6 місяців у рідкому азоті, не отримували культури MSC, незважаючи на кріозахист 10% диметилсульфоксидом (DMSO) та 5% гліцерином [36]. Як DMSO, так і гліцерин є відомими кріопротекторами, що використовуються для запобігання пошкодженню клітин під час заморожування запасів клітинних культур шляхом переривання внутрішньоклітинного утворення кристалів льоду. Проте збереження живих клітин у зразку WJ, приготовленому з 1,5 М ДМСО та 0,1 М сахарози шляхом повільного заморожування (але не шляхом склування), було продемонстровано в 2012 р. [37]. Ще переконливіші дані про отримання МСК з тканин УХ після зберігання в рідкому азоті були опубліковані в 2013 році; ці МСК були фенотипово та функціонально ідентичними таким, що отримували зі свіжих тканин [38]. Кілька наукових груп повідомляли про свій успіх протягом 2014–2018 рр., Пропонуючи різноманітні протоколи кріоконсервації тканини UC. Результати представлені в таблиці 1.

Іншою проблемою, яка критично обмежує клінічну придатність кріоконсервованих МСК, отриманих з тканини UC, є наявність білків ксено у середовищі кріоконсервації, яке зазвичай містить до 90 об.% Фетальної телячої сироватки. Застосування вільних від ксеносу середовищ значно підвищує ефективність ізоляції MCS із кріоконсервованих зразків UC [43, 44], тоді як подальше вирощування клітин у вільних від ксенону умовах сприяє суттєвому всебічному поліпшенню їх властивостей (зниження апоптозу та імуногенності, посилена проліферація, посилена секреція фактора росту гепатоцитів та простагландину Е2) [45, 46]. Цілком ймовірно, що запропонована заміна телячої сироватки на аутологічну сироватку або відповідні фармакологічні речовини (наприклад, альбумін сироватки людини) з часом переважатиме. На наш погляд, ксено-вільний стандарт кріоконсервації тканин UC повинен бути введений якомога швидше.

Сучасні перспективи банківського обслуговування UC

Висновки

Огляд недавньої літератури вказує, що найближчим часом слід очікувати великого попиту на кріоконсервацію тканин UC людини. Вибір протоколу кріоконсервації залежить від завдання - збереження кровоносних судин, ВЖ або клітинного компонента. На ефективність отримання живих клітин з розморожених тканин UC значною мірою впливає склад кріопротекторного середовища, режим заморожування та протокол, який використовується для виділення клітин. Незважаючи на те, що доступно мало даних про виживання ендотеліальних або епітеліальних клітин у кріоконсервованих тканинах UC, деякі сучасні протоколи дозволяють отримувати MSC з тканин UC після кріосховища, які фенотипово та функціонально ідентичні таким, що отримані із свіжих тканин.