Конгруентна еволюція фізичної форми та генетичної стійкості у вірусу везикулярного стоматиту

Ізабель С. Новелла

Кафедра медичної мікробіології та імунології, Медичний коледж, Університет Толедо, Науковий кампус, Толедо, штат Огайо, США

Джон Б. Преслойд

Камерон Бук

Клаус О. Вільке

Центр обчислювальної біології та біоінформатики, Секція інтегративної біології та Інститут клітинної та молекулярної біології Техаського університету в Остіні, Остін, штат Техас, США b

Пов’язані дані

Анотація

ВСТУП

Схильна до помилок реплікація РНК-вірусів призводить до розвитку популяцій квазівидів (1–4), хмар тісно пов’язаних мутантів у балансі відбору мутацій (5–7). У популяціях квазівидів підвищена генетична стійкість може забезпечити селективну перевагу (8–11), оскільки менша кількість нащадків втрачається в результаті шкідливих або летальних мутацій. Генетична стійкість тут визначається як фенотипова незмінність, незважаючи на мутаційний тиск (12). Що стосується ландшафтів фітнесу, вибір надійності надає перевагу тим групам населення, які сидять на широких піках фітнесу замість вузьких піків фітнесу. Дослідження на цифрових організмах показали перевагу цього типу широких піків і призвели до виразу "виживання найплідніших" (13). Багато досліджень, присвячених значущості генетичної стійкості до еволюції молекул РНК, є комп'ютерним аналізом та моделюванням еволюції (11, 14-17). Цей підхід призвів до виявлення вибору для стійкості в геномах вірусу гепатиту С (18) та мікроРНК (19).

Розуміння надійності має особливе значення для розробки противірусних препаратів та вакцин. Смертельний мутагенез (30) полягає у збільшенні частоти мутацій для утворення популяцій з такою кількістю мутацій, що генетична інформація втрачається, і вірус не може реплікуватися (3, 6, 31). Цей підхід мав би обмежену користь, якщо вірус може адаптуватися, збільшуючи свою стійкість (32), але комп'ютерне моделювання припускає, що генетична стійкість сама по собі навряд чи може запобігти зникненню летальним мутагенезом (33). У пікорнавірусів, здається, існує кореляція між стійкістю та чутливістю до летального мутагенезу (34). Основним недоліком живих аттенуйованих вакцин є можливість реверсії під час реплікації у вакцинованого. Простіше кажучи, реверсія є випадком адаптації до людини-господаря, і оскільки ця адаптація залежить від наявності корисних змін, неважко уявити, що більш надійний вакцинний штам також буде безпечнішим вакцинним штамом. Однак суперечливим є питання про те, чи збільшені межі стійкості чи сприяють еволюційності (35–37).

Теоретичні та молекулярні міркування забезпечують зв'язок між генетичною стійкістю та термостабільністю (38–40), а робота над фагом phi-6 показала, що клони з високою стійкістю розвинули більшу термостабільність, ніж клони з низькою стійкістю (41). Робота над мікроРНК суперечлива, і хоча результати експериментів, здавалося б, демонстрували некорельовану генетичну стійкість та термічну толерантність (19), існують розбіжності щодо інтерпретації даних (42).

У цьому звіті ми використовували немутанізовані штами VSV, щоб перевірити, чи збільшений чи розслаблений відбір призвів до змін у генетичній стійкості та чи існує взаємозв'язок між стійкістю та термостійкістю. Ми проаналізували колекцію штамів, яку ми створили при проходженні від бляшки до бляшки (43, 44) або при проходженні великої популяції (29). Проходи від бляшки до бляшки мінімізують відбір, тоді як проходи з великою кількістю населення - відбір. Наші результати показали, що, як і передбачалося, за відсутності відбору спостерігалася втрата стійкості, тоді як при наявності відбору стійкість покращилася. Ми також виявили, що стійкість не потребує співвідношення з термостабільністю в VSV; однак, за відсутності відбору, генетична архітектура VSV, здається, накладає помірно сильний взаємозв'язок між міцністю та термостабільністю. Нарешті, несподівано, термостабільність зростала під час проходів від нальоту до бляшки, навіть незважаючи на те, що міцність знижувалася.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Клітини та віруси.

Визначення фізичної форми.

Фітнес вимірювали у безпосередній конкуренції, як описано раніше (45, 49). Для штамів, отриманих від wt, ми використовували MARM U як еталон, а для штамів, отриманих від MARM U, ми використовували wt як еталон. Підводячи підсумок, двох конкурентів змішували, і суміші використовували для визначення їх відносних співвідношень за допомогою аналізів нальоту у присутності та відсутності I1 MAb, а також для проведення змагального пасажу з 2 × 10 5 PFU. Через 20 - 24 год титри вірусу досягали приблизно 10 10 ПФУ/мл, а потомство від змагання використовувалось для кількісного визначення співвідношень та проведення другого змагального проходу за тих самих умов. Після декількох пасажів зміни співвідношення журналу були представлені з часом, а антилогарифмом нахилу придатності було значення фітнесу.

Вимірювання міцності.

Ми використовували стійкість до мутагенезу як сурогат стійкості. Ми засіяли колби Т-25 клітинами BHK-21 і після зростання протягом ночі обробили отримані напівпроточні моношари 5 мл розчину 5-фторурацилу (FU), розчиненого в MEM плюс FBS при кінцевій концентрації 0 (контроль), 10, 35 або 100 мкг/мл. Через 6,5 год інкубації при 37 ° С, під час якої концентрація лікарського засобу всередині клітин врівноважується, моношари інфікували приблизно 10 5 PFU, а інфекції контролювали на предмет цитопатичного ефекту (CPE), який розвивався повільніше із збільшенням концентрації мутагену, отже, за відсутності мутагену це було завершено через 24 год. післяінфекції, у присутності 10 мкг/мл це зайняло 48 год., а в присутності 35 або 100 мкг/мл - 72 год. Всі штами відновлювались одночасно у присутності даної кількості препарату. Коли CPE був завершений, ми відновили урожайність вірусів та визначили титри шляхом повторного аналізу нальоту. Потім ми нормалізували титри, поділивши їх на контрольний титр.

Для кількісної оцінки стійкості ми регресували трансформовані в журнал, нормалізовані титри проти концентрацій FU, перетворених у квадратний корінь. Дані були майже лінійними після цього перетворення для всіх мутантів (див. Малюнки в додатковому матеріалі). Лінія регресії була придатною без перехоплення, оскільки перетворений в журнал нормалізований титр за визначенням повинен бути нульовим. Ми використовували нахил лінії як міру міцності. Усі значення нахилу від’ємні, а більш негативний нахил вказує на більшу чутливість до FU і, отже, на меншу стійкість.

Визначення частоти мутантів.

Для масових та похідних популяцій ми визначили частоту I1-стійких мутантів. Зразки із заморожених запасів розводили за необхідності та титрували в трьох повторних аналізах нальоту без I1 для розрахунку загальної концентрації вірусу. Паралельно ми використовували більш концентровані зразки (як правило, на 3-4 порядки більше концентровані) для проведення аналізів нальоту при наявності надлишкових концентрацій I1 в агарозному шарі. Важливо, що ми не обробляли вірус антитілами до посіву, оскільки це лікування призвело б до значного заниження частоти мутантів через фенотипове змішування та приховування (50, 51). Номери бляшок за цих умов представляли б кількість мутантів MARM на складі. Для обчислення частоти мутантів ми визначили середні значення MARM, поділені на середні маси.

MARM U та похідні популяції вже стійкі до I1 та інших антитіл, спрямованих до сайту A, таких як I3 (52, 53), тому ми використовували I14, інше антитіло, яке розпізнає інший антигенний сайт (сайт B) (52, 53). Процедури, яких ми дотримувались, були такими ж, як і для I1-стійкої мутантної частоти, за винятком зміни антитіл у напівтвердих агарозних накладках.

Кількісне співвідношення фізичних частинок до інфекційних частинок.

Визначення термостабільності.

Ми вимірювали термостабільність при 37 і 39 ° C. Ми взяли 500 мкл запасу вірусу в пробірку Еппендорфа і помістили його в інкубатор при 37 ° C. Ми відбирали 100 мкл зразків у нульовий час, розводили кожну пробу за необхідності через 1, 2 та 3 дні та проводили аналіз нальоту в трьох примірниках. Нахил виживання вірусу в порівнянні з часом дає вимірювання термостабільності. Ми виключили потенційний внесок агрегації та адгезії до стінки трубки у всіх штамів вузького місця з мутаціями G ORF, що призвело до значень, які не суттєво відрізнялися від тих, що були у аналізах у пластикових пробірках (P = 0,243 за парними t тест).

РЕЗУЛЬТАТИ

Міцність зростає під час адаптивної еволюції.

Одне з передбачень теорії квазівидів полягає в тому, що адаптація призведе до популяцій підвищеної стійкості. Ми перевірили цю гіпотезу, визначивши чутливість до FU у популяціях VSV, утворених після 25 пасажів великої популяції (w25A, w25D та w25E). За цих умов відбір для підвищення фізичної форми є переважною еволюційною силою, а вірусна придатність постійно зростає (29, 56). Малюнок 1А показує, що відібрані популяції мали значно вищу стійкість до FU, ніж wt родоначальник (P = 0,006 за t-тестом з одного зразка; n = 3). (Ми розрахували стійкість/стійкість до FU як нахил у регресії перетвореного в журнал нормалізованого титру вірусу проти квадратного кореня концентрації FU [див. Рис. S1 у додатковому матеріалі]. Більш негативні числа означають меншу стійкість. )

Еволюція під відбором. (A) Зміни в міцності. Адаптовані wt штами мають значно підвищену міцність порівняно з wt. (Б) Зміни у співвідношенні між фізичними частинками та ПФУ. Адаптовані штам wt мають значно нижчі співвідношення. (C) Частота мутантів проти стійкості для трьох адаптованих wt штамів. Частота мутантів зростає із збільшенням стійкості. Однак ця тенденція не є суттєвою.

Аналізи нальоту визначають живий вірус і не можуть дати оцінки летальних мутацій. Ми перевірили, чи відрізняються відмінності в чутливості до ФУ зі зміною частоти мутантів, що несуть летальні мутації, визначаючи співвідношення фізичних частинок/інфекційних частинок. Ми використовували кількісну зворотну транскрипцію-ПЛР для вимірювання кількості копій геномної РНК, що представляє кількість фізичних частинок у VSV. Співвідношення молекули РНК/ПФУ штамів, що підлягають відбору (w25A, w25D та w25E), були значно нижчими, ніж у попередника wt (P = 0,01 за тестом t одного зразка; n = 2) (Рис. 1B), що свідчить про те, що частота шкідливих мутацій була нижчою при відборі, що надало додаткові докази того, що ці вірусні популяції мають вищу стійкість.

Ми перевірили, чи підвищена стійкість до ФУ обумовлена різницею в кількості мутацій, включених під час мутагенезу. Наприклад, більша стійкість може бути результатом вищої вірності полімерази або зниження спорідненості до препарату. Якби це було так, ми б очікували зворотної кореляції між частотою мутантів та стійкістю до FU. Ми інфікували моношари BHK-21 у присутності 10 мкг/мл FU, і ми вимірювали частоту I1-стійких мутантів серед нащадків. Ми виявили, що частота мутантів зростала зі стійкістю; однак ця тенденція не була суттєвою (рис. 1C), і жоден із штамів, що відбирались, не мав нижчих частот мутантів, ніж wt. Тому ми можемо виключити підвищену вірність полімерази як один із факторів, що сприяє підвищенню стійкості до ФУ.

Надійність втрачається під час випадкового дрейфу.

Існує кілька факторів навколишнього середовища, які знижують ефективність відбору. Відбір у вірусних популяціях може бути зведений до мінімуму шляхом коінфекції через комплементацію, що призводить до загальної втрати стійкості у фазі РНК phi-6 (26). Іншим засобом мінімізації відбору є випадкова передача окремих вірусних частинок. Цей тип режиму є найбільш екстремальним вузьким місцем, і його можна легко виконати в лабораторії шляхом випадкового підбору окремих бляшок (46). За цих умов домінує довільний дрейф і спостерігається загальна втрата фізичної форми (46). Ми висунули гіпотезу про те, що стійкість розвиватиметься за тією самою схемою, тож втрата надійності буде загальною.

Ми протестували 16 штамів VSV, породжених MARM U, за допомогою 20 проходів від бляшки до бляшки. Як і раніше, ми спочатку визначили їх чутливість до FU (див. Рис. S2 у додатковому матеріалі) та порівняли його з чутливістю їх попередника MARM U. Малюнок 2А показує результати, які підтверджують нашу гіпотезу. Усі 16 штамів були більш чутливими до FU, ніж попередник MARM U. Цей результат був дуже значущим (P = 0,000015 за тестом t-вибірки; n = 16).

Еволюція в умовах дрейфу. (A) Зміни в міцності. MR-штами значно знизили стійкість порівняно з MARM U. (B) Зміни у співвідношенні між фізичними частинками та PFU. Немає суттєвої різниці між MARM U та штамами MR. (C) Частота мутантів у порівнянні з робастністю для штамів MR (без відхилення MRz; r = 0,34; P = 0,27). Ми не спостерігаємо кореляції між частотою мутантів та стійкістю.

Наступний експеримент полягав у визначенні співвідношення фізичних частинок/ПФУ. Були значні варіації між штамами (рис. 2Б), але загалом не було змін у співвідношеннях (Р = 0,15 за t-тестом одного зразка; n = 16).

Нарешті, ми дослідили можливість того, що відмінності в чутливості до FU були зумовлені різницею в точності полімерази у присутності мутагену. Ще раз ми розрахували частоту мутантів у цих популяціях після реплікації у присутності 10 мкг/мл FU. Оскільки всі вони є потомками MARM U, вони вже повністю стійкі до антитіла I1, тому ми протестували стійкість до антитіла I14, яке розпізнає інший антигенний сайт у глікопротеїні G (52, 53). Ми не виявили жодної кореляції між частотою мутантів та стійкістю (r = -0,014; P = 0,96; n = 13), тому ми не могли пояснити нижчу стійкість в результаті вищих показників мутації (рис. 2C). Цей результат узгоджується з нашими попередніми висновками, що MRr та MRb мають геномні мутантні частоти, які не відрізняються від частот їх попередника MARM U (29).

Співвідношення між фізичною формою та стійкістю.

Теорія квазівидів передбачає, що відбір впливає на дві фенотипові риси: підготовленість та стійкість. Ми виявили, що режим, який зводить до мінімуму вибір, такий як проходи від нальоту до бляшки, в цілому призвів як до втрати фізичної форми, так і до втрати стійкості (рис. 3; також див. Рис. S2 у додатковому матеріалі). На відміну від цього, ми виявили, що режим, який максимізує відбір, такий як пасажі великої популяції, давав штами з підвищеною придатністю та підвищеною стійкістю (рис. 3; також див. Рис. S1). Крім того, разом взявши результати для всіх штамів, ми виявили чудову і статистично значущу кореляцію між придатністю та стійкістю (рис. 3), що узгоджується з розглянутими теоретичними прогнозами.

Фітнес проти стійкості для всіх штамів, використаних у цьому дослідженні. Умовні позначення стосуються штамів: суцільне коло, штами МР; відкрите коло, MARM U; суцільні трикутники, пристосовані за вагою штамів; відкритий трикутник, мас. Існує сильна позитивна кореляція між трансформованою в журнал придатністю та стійкістю (пунктирна лінія; r = 0,57; P = 0,009; без відхилення MRq, r = 0,85 та P = 4,197e −06).

Недосконала кореляція між міцністю та термостабільністю.

Термостійкість у порівнянні з міцністю для всіх штамів, використаних у цьому дослідженні. Символи стосуються штамів: суцільне коло, штами МР; відкрите коло, MARM U; суцільні трикутники, пристосовані за вагою штамів; відкритий трикутник, мас. Існує позитивна кореляція між термостійкістю та стійкістю для штамів MR при 37 ° C (пунктирна лінія; r = 0,58; P = 0,018; без відхилення MRi, r = 0,79 та P = 0,0004) (A) та при 39 ° C ( пунктирна лінія; r = 0,74; P = 0,016) (B).

ОБГОВОРЕННЯ

Ми показали, що мутаційна стійкість VSV може істотно змінитися під час еволюції, навіть коли сама стійкість не підпадає під вибір. Як передбачає теорія, простий вибір для підвищення фізичної форми призводить до еволюції підвищеної стійкості; ймовірно, що вірус принаймні частково підвищує фізичну форму за рахунок зменшення шкідливого ефекту мутацій. Навпаки, за випадкового дрейфу стійкість значно знижується. Цей висновок ще раз підтверджує теоретичний аргумент про те, що стійкість - це еволюційна властивість (16, 38, 57).

Представлені тут результати узгоджуються з попередньою роботою, в якій ми продемонстрували низьку стійкість MRr за допомогою розподілу фітнесу (29). Тут ми використали чутливість до ФУ, щоб дійти того ж висновку. Крім того, MRr був одним з найбільш чутливих штамів, і лише MRz та Jerry мали нижчі значення (див. Рис. S2 у додатковому матеріалі). На відміну від цього, використовуючи розподіл фітнесу, ми не змогли знайти дефект пристосованості MRb, і лише після періоду адаптації виявилися докази низької стійкості (29). Однак, використовуючи чутливість до FU, ми виявили різницю між стійкістю MRb (-1,84 ± 0,099) та його попередником MARM U (-1,55 ± 0,035). Цей результат демонструє, що вимірювання стійкості до мутагенезу є більш чутливим методом, ніж трудомістка альтернатива вимірювання придатності окремих бляшок для отримання розподілу фітнесу.

Цікаво, що всі деформації під випадковим дрейфом мали певну втрату стійкості, навіть ті, що зросли у формі (MRa та MRy). Не було ніякої кореляції між стійкістю та кількістю мутацій, накопичених під час дрейфу (не показано), і ми виявили втрату стійкості у штамів, які відрізнялись від попередника MARM U лише двома мутаціями (MRb, MRe та MRl). Цей результат не дивно, оскільки зростають докази поширення епістазів у геномах РНК-вірусів (44, 58–61).

Не було різниці між міцністю MARM U (-1,55 ± 0,03) та масою (-1,57 ± 0,04), але, на диво, ми виявили значні відмінності в термостабільності. MARM U був значно більш термостабільним, ніж мас. (Р = 0,015 за тестом з двома зразками; різниця в середніх значеннях, 0,12). Той факт, що різниця між цими двома штамами є єдиною мутацією глікопротеїну, що призводить до зміни розпізнавання антитіл (53), підвищує можливість кореляції між антигенністю та термостабільністю, яку ми зараз вивчаємо.