Кишковий Ralstonia pickettii посилює непереносимість глюкози при ожирінні

Ролі Курація даних, написання - оригінальний проект

ralstonia

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Ролі Формальний аналіз

Лабораторія Валленберга, Університет Гетеборга, Університетська лікарня Салгренська, Гетеборг, Швеція

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Методологія ролей, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Ролі Формальний аналіз

Affiliation Université catholique de Louvain, WELBIO (Валлонський досвід у галузі наук про життя та біотехнології), Інститут досліджень наркотиків від Louvain, Брюссель, Бельгія

Ролі Курація даних

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Ролі Курація даних

Афілійована лабораторія мікробіології, Університет Вагенінгена, Вагенінген, Нідерланди

Ролі Формальний аналіз

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Афілійований відділ внутрішньої медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Ролі Курація даних

Афілійований відділ внутрішньої медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Ролі Курація даних

Центр діабету Affiliations, Кафедра внутрішньої медицини, Медичний центр університету VU, Амстердам, Нідерланди, ICAR, Медичний центр університету VU, Амстердам, Нідерланди

Афілійована лабораторія мікробіології, Університет Вагенінгена, Вагенінген, Нідерланди

Ролі Формальний аналіз, нагляд

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Афілійована лабораторія мікробіології, Університет Вагенінгена, Вагенінген, Нідерланди

Ролі Курація даних

Лабораторія Валленберга, Університет Гетеборга, Університетська лікарня Салгренська, Гетеборг, Швеція

Партнерське відділення хірургії, лікарня Флево, Алмере, Нідерланди

Афілійоване відділення хірургії лікарні Сінт-Лукаса Андреаса, Амстердам, Нідерланди

Афілійований відділ внутрішньої медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Афілійований відділ внутрішньої медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Афілійований відділ судинної медицини Академічного медичного центру, Амстердам, Нідерланди

Відділення судинної медицини, Академічний медичний центр, Амстердам, Нідерланди, відділення педіатрії, Університетський медичний центр Гронінген, Гронінгенський університет, Гронінген, Нідерланди

Ролі Концептуалізація, супервізія, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Лабораторія Валленберга, Університет Гетеборга, Університетська лікарня Салгренська, Гетеборг, Швеція, Центр фундаментальних досліджень метаболізму Novo Nordisk, Секція метаболічної рецептології та ентероендокринології, Факультет медичних наук, Університет Копенгагена, Копенгаген, Данія

Ролі Концептуалізація, ресурси, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Філіальна лабораторія мікробіології, Університет Вагенінгена, Вагенінген, Нідерланди, Іммунобіологія РПУ, Гельсінський університет, Гельсінкі, Фінляндія

Ролі Концептуалізація, придбання фінансування, ресурси, нагляд, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Відділення судинної медицини, Академічний медичний центр, Амстердам, Нідерланди, лабораторія Валленберга, Університет Гетеборга, Університетська лікарня Sahlgrenska, Гетеборг, Швеція, відділення внутрішніх хвороб, Академічний медичний центр, Амстердам, Нідерланди, Центр діабету, Внутрішній відділ медицина, Медичний центр університету VU, Амстердам, Нідерланди, ICAR, Медичний центр університету VU, Амстердам, Нідерланди

  • Шантхадеві Д. Удаяппан,
  • Петя Коватчева-Датчарі,
  • Гвідо Дж. Баккер,
  • Стефан Р. Хавік,
  • Хільде Геррема,
  • Патріс Д. Кані,
  • Крістіен Е. Бутер,
  • Клара Белзер,
  • Юлія Дж. Віт'єс,
  • Енн Вріз

Виправлення

30 січня 2018: Персонал PLOS ONE (2018) Корекція: Кишковий Ralstonia pickettii посилює непереносимість глюкози при ожирінні. PLOS ONE 13 (1): e0192339. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192339 Перегляд виправлення

Цифри

Анотація

Змінений склад мікробіоти кишечника був залучений до патогенезу метаболічних захворювань, включаючи ожиріння та цукровий діабет 2 типу (T2DM). Запалення низького ступеня, потенційно ініційоване кишковою мікробіотою, вважається рушійною силою розвитку інсулінорезистентності при ожирінні. Тут ми повідомляємо, що бактеріальна ДНК присутня в мезентеріальній жировій тканині ожирілих, але здорових людей. Піросеквенування бактеріальних генів 16S рРНК виявило, що ДНК грамнегативних видів Ralstonia була найбільш поширеною. Цікаво, що кількість калових мас Ralstonia pickettii було збільшено у осіб із ожирінням, які страждали від діабету та СД2. Щоб оцінити, чи був Р. pickettii причинно спричинений розвитком ожиріння та T2DM, ми провели дослідження доказів концепції у мишей із ожирінням (DIO), викликаних дієтою. У порівнянні з контрольними мишами, обробленими носієм, миші DIO, які отримували R. pickettii, мали знижену толерантність до глюкози. Крім того, у мишей, оброблених R. pickettii, підвищений рівень циркулюючого ендотоксину. На закінчення, це дослідження свідчить про те, що кишкова ралстонія підвищується у людей із ожирінням, які страждають на T2DM, і взаємно погіршує толерантність до глюкози у мишей DIO.

Цитування: Удаяппан С.Д., Коватчева-Датчарі Р, Баккер Г.Дж., Хавік С.Р., Геррема Х., Кані П.Д. та ін. (2017) Кишкова Ralstonia pickettii посилює непереносимість глюкози при ожирінні. PLOS ONE 12 (11): e0181693. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181693

Редактор: Тріантафіллос Чавакіс, Технічний університет Дрездена, НІМЕЧЧИНА

Отримано: 13 січня 2017 р .; Прийнято: 4 липня 2017 р .; Опубліковано: 22 листопада 2017 р

Наявність даних: Усі відповідні дані містяться у статті, в допоміжних файлах інформації та з Цифрового сховища Dryad за адресою https://doi.org/10.5061/dryad.q5s51.

Конкуруючі інтереси: У нас є такі інтереси. Це дослідження частково фінансувалося страховими компаніями AFA. М.Н. та W.M.deV. є засновниками, власним капіталом та входять до складу Науково-консультативної ради Caelus Pharmaceuticals, Нідерланди; WMdV є членом Науково-консультативної ради Chr Hansen Horsholm Danmark та M.N. та W.M.deV. є засновниками, власним капіталом та входять до складу Науково-консультативної ради Caelus Pharmaceutical (NIHS) Лозанна, Швейцарія. Ф.Б. є засновником MetaboGen AB, Швеція. Ф.Б. та власний власний капітал G.B у MetaboGen AB, Швеція. Жодне з них не має прямого відношення до поточного документу. Немає заявлених патентів, продуктів, що розробляються, або продуктів, що продаються. Це не змінює нашої дотримання всіх політик PLOS ONE щодо обміну даними та матеріалами, як це докладно викладено в Інтернеті в посібнику для авторів.

Вступ

Всесвітня епідемія ожиріння, яка є основним фактором ризику інсулінорезистентності, зумовлює розвиток таких загальних захворювань, як цукровий діабет 2 типу (T2DM), дисліпідемія та серцево-судинні захворювання [1]. Розвиток ожиріння та T2DM є складним і обумовлений як середовищем, так і генетичними факторами [2]. Індуковані ожирінням запальні зміни білої жирової тканини вважають, що вони відіграють вирішальну роль у патофізіології ожиріння та T2DM. Хоча більша частина нашого жирового депо розташована в підшкірній жировій тканині, приблизно 10–20% від загальної маси жирової тканини знаходиться внутрішньочеревно [3]. Особливо мезентеріальне запалення жирової тканини вісцеральної зони пов’язане з резистентністю до інсуліну, що відображається зниженням рівня адипонектину в плазмі крові, що пов’язано з розвитком резистентності до інсуліну [4] та припливом макрофагів [5]. У свою чергу, резистентність до інсуліну корелює з регуляцією вісцеральних жирових генів, що беруть участь у вродженому імунітеті та запаленні [5].

Збільшення кількості даних свідчить про те, що склад мікробіоти кишечника пов’язаний із споживанням енергії та ожирінням [6], а також з розвитком хронічного запалення низького ступеня та резистентності до інсуліну [7, 8]. Це підтверджується даними, які свідчать про те, що (постпрандіальні) ендотоксини, отримані від грамнегативних кишкових бактерій, беруть участь у хронічному запаленні низької ступеня та резистентності до інсуліну [9–11]. Дійсно, було встановлено, що ступінь ендотоксемії передбачає резистентність до інсуліну та розвиток T2DM у інших здорових людей із ожирінням [12] через процес, який, як вважають, походить від порушення функції кишкового бар’єру [13]. Дослідження мишей показали, що макрофаги в брижовій жировій тканині дійсно містять бактеріальну ДНК, яка походить з кишечника [14]. Однак залишається довести, що конкретні кишкові бактерії справді є причиною патогенезу резистентності до інсуліну [15].

Тут ми повідомляємо, що бактеріальну 16S рДНК, включаючи грамнегативні види Ralstonia, можна ідентифікувати в мезентеріальній вісцеральній жировій тканині людей із ожирінням, які в іншому випадку були здоровими. Цікаво, що в окремій когорті пацієнтів із ожирінням з T2DM кількість фекалій Ralstonia pickettii була збільшена порівняно з контролем ожиріння без діабету. Щоб оцінити потенційну причинну роль R. pickettii у розвитку діабетоподібного фенотипу в модельній системі ожиріння, ми протягом чотирьох тижнів лікували мишей, страждаючих ожирінням (DIO), індукованих дієтою. Цікаво, що миші DIO, оброблені R. pickettii, мали знижену толерантність до глюкози порівняно з контролем, обробленим гліцерином.

Результати

Ідентифікація бактеріальної ДНК Ralstonia у мезентеріальній вісцеральній жировій тканині у людей, що страждають ожирінням

Бактеріальна 16S рДНК була ампліфікована ПЛР з ДНК, виділеної з людських мезентеріальних вісцеральних біоптатів жирової тканини, тоді як ампліфікація ПЛР з біоптатів сальникової або підшкірної жирової тканини ледве дала амплікони 16S рДНК. Амплікони з ДНК, виділеної з мезентеріальної жирової тканини, піддавали денатураційному градієнтному гель-електрофорезу (DGGE), профілюючи (Фіг. 1А). Подальше секвенування за Сангером виявило, що домінуюча смуга виявила найбільшу схожість з Ralstonia spp. Піросеквенсинг-аналіз штрих-кодованих ампліконів рДНК 16S, отриманих з тієї самої ДНК, виявив сім родів бактерій у мезентеріальній вісцеральній жировій тканині людей, що страждають ожирінням. Актинобактерії були найбільш поширеними грампозитивними, а Ralstonia - найбільш поширеними грамнегативними бактеріями (рис. 1В). Беручи до уваги нові дані на місцях, які свідчать про те, що ендотоксин, похідний від грамнегативних бактерій, бере участь у метаболічній ендотоксемії та знижує толерантність до глюкози [9, 14, 16], для цього проекту ми зосередили увагу на ролі ралстонії в гомеостазі глюкози.

Протягом чотиритижневого періоду лікування збільшення ваги при HI-R. DIO-мишей, оброблених пікетті, було збільшено порівняно з контролем, обробленим гліцерином та R. pickettii (Фіг. 2А). Важливо, однак, зазначити, що HI-R. Миші DIO, які отримували пікетті, мали на початку періоду лікування дещо більшу масу тіла. Незважаючи на те, що ми не можемо повністю пояснити цю розбіжність, це може частково сприяти збільшенню відносного збільшення ваги (рис. 2B) при лікуванні HI R. pickettii. Відсік білої жирової тканини епідидиму (eWAT) був значно збільшений у HI-R. мишей, оброблених пікетті, порівняно з мишами, обробленими гліцерином та R. pickettii, тоді як мезентеріальні та ниркові відділення ВАТ не відрізнялися між групами (рис. 2С). Вміст R. pickettii був підвищений у фекаліях HI-R. pickettii та R. pickettii, оброблених мишами, порівняно з контрольованими гліцерином контролями (фіг. 2D). На відміну від цього, ДНК R. pickettii не збільшувалась у мезентеріальній білій жировій тканині (mWAT) HI-R. мишей, оброблених pickettii, порівняно з контролем гліцерину, тоді як у мишей, оброблених R. pickettii, підвищений рівень ДНК R. pickettii у цьому відділі жирової тканини (рис. 2Е). Це говорить про те, що живі бактерії можуть знадобитися для транслокації з кишечника відповідно до попередньої знахідки (14).

Дослідження DIWA (рис. 1C та 1D) включало жінок із надмірною вагою (середній вік 70 років, ІМТ від 25,8 до 28 кг/м2) з нормальною толерантністю до глюкози (NGT), порушеною толерантністю до глюкози (IGT) або цукровим діабетом 2 типу (T2DM) . Критеріями виключення були хронічні запальні захворювання та лікування антибіотиками протягом попередніх трьох місяців. Детальніше про цю когорту було описано в інших роботах [7, 17]. Усі суб'єкти дали інформовану згоду та надали свіжий ранковий зразок стільця.

Тварини

Самців мишей C56BL6/J отримували з лабораторій Charles River. Мишей випадковим чином розподіляли по групах лікування. Мишей годували стандартною лабораторною дієтою чау (Research Diets Inc., США) або дієтою з високим вмістом жиру (HFD) (60% Ккал жиру, D12492, Research Diets Inc., США), як зазначено в рукописі. Дієтичні компоненти HFD представлені в таблиці 1.

Дієтичне ожиріння (DIO) було реалізоване шляхом годування мишей HFD протягом восьми тижнів, починаючи з чотиритижневого віку. Мишей утримували у постійному 12-годинному циклі світло-темно з контрольованою температурою та вологістю та отримували доступ до їжі та води за бажанням.

Починаючи з віку 13 тижнів, Ralstonia pickettii (DSM 6297, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) вводили щодня протягом чотирьох тижнів пероральним введенням (10 6 КУО в 10% гліцерині в PBS, кінцевий об'єм 100 мкл). В якості контролів використовували інактивований теплом (10 хв при 70 ° C) R. picketti (10 6 КУО у 10% гліцерину-PBS, кінцевий об'єм 100 мкл) та гліцерин (10% у PBS, кінцевий об'єм 100 мкл). Теплова інактивація повністю погіршує здатність R. pickettii рости (S2 Рис.). Життєздатність та чистоту всіх R. pickettii, що зберігаються при -80 ° C, перевіряли до 12 місяців шляхом культивування та секвенування. Збільшення ваги та споживання їжі контролювали протягом усього періоду лікування. Кал збирали на клітку (n = 5 мишей на клітку) протягом третього тижня лікування.

Пероральні тести на толерантність до глюкози (OGTT) проводили на третьому тижні періоду лікування. Мишей голодували протягом 4 годин, а рівень глюкози в крові вимірювали від кінчика хвоста. Миші отримували перорально болюсно D-глюкози (2 г/кг маси тіла у 200 мкл стерильного фізіологічного розчину), а рівень глюкози в крові згодом вимірювали при t = 30, 60, 90 та 120 хв.

Після чотирьох тижнів лікування R. pickettii - або контрольного лікування мишей припиняли пункцією серця під анестезією на пентобарбіталі натрію. Кров збирали в пробірки, покриті EDTA, і витримували на льоду до центрифугування (8000xg, 4 ° C, 20 хв). Плазму аликвотно розподіляли і негайно використовували для аналізу або зберігали при -80 ° C. Органи та тканини, включаючи брижову жирову тканину (вирівнюючи поперечну кишку), швидко вирізали в стерильних умовах, швидко заморозили у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C до подальшого аналізу.

Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до принципів «Посібника з догляду та використання експериментальних тварин» і були затверджені в майбутньому Інституційним комітетом з догляду та використання тварин («Dierexperimentencommisse» (DEC) Академічного медичного центру (AMC) у Амстердам).

Виділення та секвенування ДНК бактерій

Геномну ДНК як прокаріотичного, так і еукаріотичного походження виділяли з біопсій за фенол-холоформним методом, як описано Zoetendal et al. [37]. Коротше кажучи, стандартизовану кількість жирової тканини обробляли сумішшю SDS і протеїнази К при 55 ° C і гомогенізували механічним руйнуванням із використанням цирконієвих скляних гранул (1 мм) у FAST Prep-24 (MP Biomedical) у присутності фенолу . Геномну ДНК екстрагували за допомогою серії екстракцій фенол/хлороформ і осаджували у присутності абсолютного етанолу.

Більше того, геномну ДНК піддали 454-піросеквенуванню області V4-V6 16S рРНК (використовуючи праймери 520F 5'-AYT GGG YDT AAA GNG -3 'та 1100R 5'- GGG TTN CGN TCG TTG -3') . Контрольовані якістю зчитування (нормалізовані щонайменше до 1000 зчитувань на зразок) оброблялись через конвеєр QIIME [40]. Для кількісної оцінки Ralstonia-spp. бактерій, ми провели qPCR у зразках ДНК калу та mWAT ДНК [41]. Зразки аналізували в 25-мкл реакційній суміші, що складається з 12,5 мкл буфера 1xSYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, Массачусетс, США), води, 0,2 мкМ кожного праймера і 5 мкл матриці геномної ДНК, витягнутої з калу або mWAT . Стандартна крива продукту ПЛР 16S рРНК Ralstonia pickettii була створена із застосуванням послідовного 10-кратного розведення очищеного продукту ПЛР 16S рДНК у повній довжині. Праймери qPCR базувались на R. pickettii (F ’: ATGATCTAGC-TTGCTAGATTGAT; R’: ACTGATCGTCGCCTTGGTG). Дані виражаються як копії 16S рДНК-ралстонії порівняно із загальною ДНК бактерій [42].

Вимірювання ендотоксину в плазмі

Активність ендотоксину LPS крові вимірювали за допомогою Endosafe-MCS (Charles River Laboratories, Ліон, Франція) на основі кінетичної хромогенної методології Limulus amaebocyte Lysate (LAL), яка вимірює інтенсивність кольору, безпосередньо пов’язану з концентрацією ендотоксину у зразку. Плазму розбавляли 1/10 вільним від ендотоксину буфером (Charles River Laboratories), щоб мінімізувати перешкоди в реакції, і нагрівали протягом 15 хв при 70 ° C. Кожен зразок розбавляли водою-реактивом LAL без ендотоксинів (лабораторії Чарльз-Рівер) та обробляли у двох примірниках. У детермінацію було включено два шипи для кожного зразка. Всі зразки перевірені на відновлення та варіювання коефіцієнта. Нижня межа виявлення становила 0,005 ЄС/мл [43].

Кількісна ПЛР у реальному часі.

Зрізи жирової тканини мишей (мезентеріальні та епідидимальні) гомогенізували з використанням тканини magnaLyzer (Рош, Швейцарія). Загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту Tri-pure (Roche). кДНК готували шляхом зворотної транскрипції 1 мкг загальної РНК із використанням набору зворотної транскрипції (BioRad, США). QPCR у реальному часі проводили за допомогою майстер-суміші Sensifast SYBR (GC біотехнологія). Були використані генно-специфічні праймери, що охоплюють межі інтрон-екзон, і всі результати були нормалізовані до домашнього гена 36B4. Всі зразки аналізували в двох примірниках, а дані аналізували за методом 2 ΔΔCT.

Статистичний аналіз