HBXIP та LSD1, розроблені за допомогою lncRNA Hotair Mediate Транскрипційна активація c-Myc

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: yelihong @ nankai.edu.cnzhangxd @ nankai.edu.cn

Анотація

Вступ

Ракові клітини характеризуються набуттям кількох характеристик, що дозволяють їм перетворитися на пухлинні, в яких неконтрольована проліферація є однією з найбільш фундаментальних характеристик ракових клітин (1, 2). Активація онкогенів та їх кооперативні ефекти відіграють вирішальну роль у процесі туморогенезу та проліферації клітин. Опосередковане онкогеном перепрограмування експресії генів, яке дозволяє клітині набути порушення метаболізму, клітинного циклу та інших аспектів, є ознакою ракових клітин (1, 3, 4). Важливо, що прото-онкоген c-Myc, який був залучений до патогенезу більшості типів пухлин людини (1, 5), впливає на безліч клітинних біологічних процесів, включаючи клітинний цикл, синтез білка, адгезію клітин, цитоскелет, метаболізм та регуляція мікроРНК (6–8). Білок c-Myc зв'язується з послідовністю ДНК, яка називається E-box (CACGTG), і димеризується з Максом для посередницького наближення до загальної кількості 3000 - 4000 генів людини (9, 10). білок c-Myc містить основний ДНК-зв'язуючий домен та мотив димеризації спіралі-спіралі-лейцинової блискавки (HLH-Zip), за допомогою якого інші фактори транскрипції та коактиватори можуть впливати на експресію цільових генів c-Myc (11, 12). Однак основний механізм транскрипційної регуляції генів-мішеней c-Myc залишається нерозгаданою таємницею.

Х-взаємодіючий білок гепатиту В Х (HBXIP), також відомий як LAMTOR5 (13), є білком 18 кДа, який містить лейцинову блискавку на своєму С-кінці, і його послідовність добре зберігається серед видів ссавців (14). Ми повідомляли, що експресія HBXIP, очевидно, збагачується в тканинах раку молочної залози. HBXIP діє як онкогенний транскрипційний коактиватор багатьох факторів транскрипції, таких як TF-IID, STAT3, SP1, CREB та E2F1, у стимулюванні росту та метастазування раку молочної залози (15–20). Однак, чи служить HBXIP коактиватором онкогенного транскрипційного фактора c-Myc при раку молочної залози, залишається недостатньо вивченим.

Враховуючи, що транскрипційна активація пов’язана із середовищем хроматину, модифікація гістону H3 є основною закономірністю ремоделювання хроматину (21). Опосередковане лізином деметилаза 1 (LSD1) деметилювання H3K4 призводить до місцевого окислення ДНК як рушійної сили у складі комплексу ініціації транскрипції, спричиненого c-Myc (22, 23). Епігенетика бере участь у транскрипції, опосередкованій c-Myc (24, 25). Довгі некодуючі РНК (lncRNA) з’являються як нові гравці в парадигмі раку, що демонструють потенційну роль як в онкогенному, так і в супресивному пухлинному шляху. Ці нові гени виконують чудові біологічні функції при різних видах раку людини (26). LncRNA HOX-транскрипт антисмислової міжгенної РНК (Hotair), ідентифікована як 2,2-кілобазна ncRNA, що знаходиться в локусі HOXC, може зв'язуватися з LSD1. Hotair служить лісом з комплексів модифікації гістонів, що включають LSD1 та полікомбо-репресивний комплекс 2 (PRC2), що призводить до злоякісних утворень множинних пухлин (27, 28). Повідомлялося, що lncRNA PRNCR1 та PCGEM1 беруть участь у транскрипційному комплексі андроген-рецептор (29). Однак чи брав участь Hotair в активації транскрипції, спричиненої c-Myc, недостатньо документовано.

У цьому дослідженні ми намагаємось отримати уявлення про механізм активації транскрипції, опосередкованої c-Myc. Цікаво, що наші дані показують, що HBXIP, діючи як коактиватор, безпосередньо взаємодіє з фактором транскрипції c-Myc. HBXIP і LSD1 утворюють комплекс, який Hotair встановлює для активації c-Myc в промоторі цільових генів c-Myc, що призводить до активації транскрипції генів-мішеней c-Myc у клітинах раку молочної залози. Таким чином, наш висновок дає нові уявлення про механізм, за допомогою якого c-Myc функціонує в канцерогенезі.

Матеріали і методи

Клітинні лінії, трансфекція та siРНК

Імморталізовані клітинні лінії молочної залози HBL-100 та клітинні лінії раку молочної залози MCF-7, T47D, LM-MCF-7 та SK-BR3 культивували в середовищі RPMI 1640 (Invitrogen) з 10% FCS. Клітини MDA-MB-463, MDA-MB-231 та HEK293T культивували в DMEM (Invitrogen) з додаванням 10% FCS. Раніше повідомлялося про siRNAs, націлені на мРНК HBXIP (16, 19). МіРНК, націлені на мРНК c-Myc, мРНК Hotair та LSD1, були перелічені в додатковій таблиці S1 (28). Клітини трансфікували відповідними плазмідами або siРНК з використанням ліпофектаміну 2000 (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника.

Аналізи імунопреципітації хроматину та перекриття зв'язування HBXIP та c-Myc

Аналізи імунопреципітації хроматину (ChIP) проводили з використанням набору імунопреципітації хроматину EpiQuik від Epigentek Group Inc. Клітини MCF-7 лізували через 24 години після трансфекції. Білкові/ДНК-комплекси імунопреципітували антитілами HBXIP або LSD1, використовуючи нормальний кролячий IgG як негативний контроль. Праймери, використані для ампліфікації ПЛР, фланкували E-box у промоторах цикліну A, eIF4E та LDHA (30–32). Виділення та лігування ChIP-ДНК (ChIP-DSL) та аналіз даних генів, пов'язаних з HBXIP, були проведені CapitalBio Corporation відповідно до протоколу Aviva Systems Biology. Експерименти повторювали три рази, і результати аналізували за допомогою MAS (http://bioinfo.capitalbio.com/mas/login.do) із відсіканням величини P 1,0 × 10 6 для ідентифікації промотору. Згідно з попереднім звітом (33), використовувались набори даних ChIP-seq для c-Myc. Відповідно до номера приєднання та назви гена, 1348 генів, що зв’язані з верхніми зв’язками, у наборах даних c-Myc були використані для злиття з зв’язаними з HBXIP генами для перекриття. Генні шляхи були проаналізовані за допомогою бази даних KEGG в DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/).

Імуногістохімічне фарбування

Мікрочипи тканин раку молочної залози були придбані у Біотехнології Сіань Аомей. IHC фарбування проводили, як описано раніше (16). Негативний контроль проводили, як описано вище, без використання первинного антитіла. Рівень фарбування HBXIP, цикліну A, eIF4E та LDHA класифікували на три групи із застосуванням модифікованого методу оцінки на основі інтенсивності фарбування (0, негативні; 1, низькі; 2, високі) та відсотка забарвлених клітин (0, 0% забарвлених; 1,1% –49% забарвлених; 2, 50% –100% забарвлених). Помножений бал (показник інтенсивності × відсоток балів), нижчий за 1, вважався негативним фарбуванням (-), 1 і 2 вважався помірним фарбуванням (+), а 4 - інтенсивним фарбуванням (++).

ПЛР у реальному часі та Вестерн-блот-аналіз

Всього було зібрано 40 випадків тканин раку молочної залози у пацієнтів, які перенесли резекцію раку молочної залози в лікарні Першого центру Тяньцзіня (Тяньцзінь, Китай). Загальні РНК з тканин або клітин раку молочної залози витягували за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen) відповідно до інструкцій (16). КДНК першої нитки синтезували за допомогою зворотної транскриптази PrimeScript (TaKaRa Bio) відповідно до інструкцій виробника. Праймери, що використовуються для тестування експресії HBXIP, були отримані із звітів (16). ПЛР у реальному часі проводили, як описано раніше (16). Праймери, використані в дослідженні, були перелічені в додатковій таблиці S2. Для вестерн-блот-аналізу (16) загальний білковий лізат екстрагували з тканин або клітин за допомогою буфера RIPA (Solarbio). Зразки білка піддавали SDS-PAGE, а потім переносили на нітроцелюлозну мембрану, блокували 5% нежирним молоком та інкубували з первинними антитілами протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після інкубації з вторинними антитілами протягом 1 години мембрану візуалізували за допомогою ECL (Millipore). Антитіла, використані в цьому дослідженні, були перелічені в додатковій таблиці S3. Всі експерименти повторювали 3 рази.

Конструкти

Плазміди, такі як pCMV-Tag2B, pCMV-HBXIP, pcDNA3.1, pcDNA-HBXIP, pGEX-4T1, pGEX-HBXIP та pCMV-HBXIP-LZM, використовувались у наших попередніх дослідженнях (16, 34, 35). Репортер E-box був побудований шляхом вставки 6 × E-box у вектор pGL3-Basic (36). pcDNA-Hotair вектор із повнорозмірним Hotair був побудований компанією Genomics. Людський HBXIP, c-Myc та фрагменти HBXIP ампліфікували ПЛР із кДНК загальних РНК у клітинах MCF-7. Отримані продукти клонували в безліч сайтів клонування векторів, таких як pEGFP-C2, pCMV-Tag2B, pET28, pcDNA3.1, pcDNA-HA та pGEX-4T1, відповідно.

Аналізи генів-репортерів люциферази

Плазміди репортерного вектора люциферази ренілли pRL-TK використовували, як описано раніше (16). Активність люциферази нормалізувалась до активності люциферази ренілли. Всі аналізи проводили у трьох примірниках. Клітини висівали в 24-лункові планшети і культивували протягом 24 годин перед трансфекцією. Активність люциферази репортера E-box та репортера Gal4-c-Myc визначали через 36 годин після трансфекції за допомогою набору для аналізу генів подвійної люциферази-репортера (Promega).

Імунофлуоресцентне фарбування та конфокальна мікроскопія

Імунофлуоресцентне фарбування проводили, як описано раніше (35). Після трансфекції клітини фіксували параформальдегідом і проникали 0,1% Triton X-100 у PBS. Після блокування в PBS, що містить 3% BSA, клітини інкубували з первинними антитілами при кімнатній температурі. Після промивання PBS клітини інкубували з кон’югованим флуорофором вторинним антитілом (DAKO) та DAPI. Після промивання PBS слайди монтували гліцерином і спостерігали під конфокальною мікроскопією (Leica TCS SP5).

Аналіз коімунопреципітації та зниження GST

Клітини збирали і лізували в буфері для лізису (50 ммоль/л Трис-HCl, рН 8,0, 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л фториду натрію, 1% нонідет Р-40, 1 ммоль/л дитиотреитола, 1 ммоль/L Na3VO4, 1 ммоль/л мікроцистину-LR, 1 ммоль/л фенілметилсульфонілфториду, 10 мг/мл лейпептину та 10 мг/мл апротиніну). Лізати інкубували з антитілами/білком G – кон’югованими агарозними кульками (Millipore) або аффінними гелевими кульками ANTI-FLAG M2 (Sigma). Осад промивали шість разів крижаним буфером для лізису, ресуспендували в PBS з подальшим аналізом Вестерн-блот. Зниження GST було здійснено згідно з опублікованими протоколами (16). Намистини глутатіону відновлювали коротким центрифугуванням і промивали шість разів буфером для лізису, після чого проводили Вестерн-блот-аналіз.

Аналізи зсуву рухливості електрофорезу

Детально описано протокол аналізу зсуву рухливості електрофорезу (EMSA) (16, 17). Ядерні екстракти готували з клітинами MCF-7 з використанням комплекту ядерної екстракції EpiQuik (Epigentek). Зонди генерували відпалом одноланцюгових олігонуклеотидів, що містять E-box (37). Первинне антитіло (1 мкг) інкубували з ядерними екстрактами на льоду перед тим, як зонди додавали в буфер зв'язування. Зразки інкубували на льоду, а потім розділяли електрофорезом на неденатурирующем поліакриламідному гелі, а потім гель висушували і піддавали авторадиографии.

Аналізи імунопреципітації РНК

Аналізи імунопреципітації РНК (RIP) проводили в природних умовах, як описано (29). Коротко кажучи, ядра клітин MCF-7 гранулювали та лізували. Лізати пропускали через голку калібру 27,5 4 рази для сприяння ядерному лізису. Супернатант інкубували з 4 мкг первинного антитіла кролячого анти-HBXIP або мишачого анти-c-Myc (Додаткова таблиця S3) з 40 мкл білка G-кон'югованих агарозних гранул (Millipore) або ANTI-FLAG M2 афінних гелевих гранул (Sigma). Комплекс РНК/антитіло промивали буфером NT2 (50 ммоль/л Tris-HCl, рН 7,4, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л MgCl2, 0,05% NP-40). РНК екстрагували TRIzol (Invitrogen) згідно з протоколом виробника та піддавали ПЛР-аналізу в реальному часі.

МТТ-аналізи

Аналізи росту клітин проводили з використанням реагенту МТТ (3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолію бромід) (Sigma), як описано раніше (38). Коротше кажучи, трансфіковані клітини трипсинізували, підраховували і висівали в 96-лункові планшети. Після інкубації різних періодів часу МТТ додавали безпосередньо в кожну лунку, після чого інкубували протягом 4 годин, а потім супернатант видаляли і додавали 100 мкл диметилсульфоксиду для зупинки реакції. Поглинання при 490 нм вимірювали за допомогою системи зчитування ELISA (Labsystem, Multiskan Ascent). Всі експерименти проводились у трьох примірниках.

Трансплантація тварин

Усі експериментальні процедури за участю тварин відповідали Керівництву по догляду та використанню лабораторних тварин (публікації NIH № 80–23, переглянуте 1996 р.) Та проводились відповідно до інституційних етичних рекомендацій щодо експериментів на тваринах. Клітини MCF-7 (1 × 10 7), тимчасово трансфіковані відповідними плазмідами та siRNA, підшкірно вводили у фланги 4-тижневих самців BALB/c атимічних оголених мишей відповідно. Зростання пухлини контролювали кожні 4 дні. Через 26 днів мишей забивали, проводили розтин і зважували пухлини. Обсяг пухлини (V) контролювали шляхом вимірювання довжини (L) і ширини (W) за допомогою штангенциркулів і розраховували за формулою (L × W 2) × 0,5 (16).

Статистичний аналіз

Кожен експеримент повторювали принаймні три рази. Статистичну значимість оцінювали шляхом порівняння середніх значень (± SD) за допомогою критерію t Стьюдента для незалежних груп, передбаченого для тесту P 2 або тесту Крускала – Уолліса, використовуючи програму SPSS (SPSS).