Характеристика мікробного дисбіозу та метаболічних змін у собак з гострою діареєю

Філіальна лабораторія шлунково-кишкового тракту, Відділ клінічних наук про дрібних тварин, Коледж ветеринарної медицини та біомедичних наук, Техаський університет A&M, Коледж-Стейшн, Техас, Сполучені Штати Америки

Невідкладна та критична допомога, Відділення клінічних наук про дрібних тварин, Коледж ветеринарної медицини та біомедичних наук, Техаський університет A&M, Коледж-Стейшн, Техас, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ рослинництва, Університет штату Пенсільванія, Університетський парк, штат Пенсільванія, Сполучені Штати Америки

Філія Арті Макферрін, кафедра хімічної інженерії, Техаський університет A&M, Коледж-Стейшн, Техас, Сполучені Штати Америки

Афіліації Artie McFerrin Департамент хімічної інженерії, Техаський університет A&M, Коледж-Стейшн, Техас, Сполучені Штати Америки, Департамент мікробного патогенезу та імунології, Техаський науково-медичний центр A&M, Коледж-Стейшн, Техас, Сполучені Штати Америки

Департамент харчових наук, Університет штату Пенсільванія, Університетський парк, штат Пенсільванія, Сполучені Штати Америки, Інститут раку Херші, штат Пенсільванія, Херші, штат Пенсільванія, Сполучені Штати Америки

Блейк С. Гвардія,
Джеймс В. Барр,
Лаваня Реддіварі,
Кори Клемашевич,
Арул Джаяраман,
Йорг М. Штайнер,
Джайрам Ванамала,
Ян С. Суходольський

Цифри

Анотація

Цитування: Guard BC, Barr JW, Reddivari L, Klemashevich C, Jayaraman A, Steiner JM, et al. (2015) Характеристика мікробного дисбіозу та метаболічних змін у собак з гострою діареєю. PLoS ONE 10 (5): e0127259. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0127259

Академічний редактор: Даніель Монлеон, Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA, ІСПАНІЯ

Отримано: 17 вересня 2014 р .; Прийнято: 14 квітня 2015 р .; Опубліковано: 22 травня 2015 р

Наявність даних: Послідовності були передані в Архів читання послідовностей під таким номером приєднання: SRP040310.

Фінансування: "Автор (и) не отримав (-ла) конкретного фінансування для цієї роботи."

Конкуруючі інтереси: Співавтор Ян Суходольський є членом редакційної ради PLOS ONE, і це не змінює нашу прихильність редакційній політиці та критеріям PLOS ONE.

Вступ

Матеріали і методи

Зарахування тварин та відбір зразків

Кали, зразки сироватки (зібрані за допомогою венопункції) та зразки сечі (зібрані цистоцентезом) отримували як у здорових собак, так і у собак з гострою діареєю (АД). Собаки з АД також були класифіковані як такі, що мають негеморагічну діарею (NHD) або геморагічну діарею (AHD) (Таблиця 1). Кал охолоджували відразу після збору, переносили протягом декількох годин у морозильну камеру -80 ° C і зберігали замороженим до обробки для вилучення ДНК. Зразки сироватки та сечі аликвотно розподіляли і зберігали замороженими при -80 ° C до обробки. Власники надали письмову згоду на використання своїх собак у цьому дослідженні. Збір фекалій, сироватки та сечі був затверджений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Техаського університету мистецтв і технологій (IACUC): номер протоколу; 2012–101. Жодна із здорових собак або собак з гострою діареєю не використовувалась у попередньому дослідженні [14].

Контрольну групу складали 13 здорових домашніх собак (таблиця 1, таблиця S1). Всі собаки були приватною власністю, жили в різних домашніх умовах і годували різними комерційними дієтами. Жодна із собак не мала анамнезу шлунково-кишкових ознак або прийому антибіотиків принаймні за місяць до забору зразків калу. Всі здорові собаки жили в Техасі, США.

Група хворих складалася з 13 собак із гострою діареєю (6 собак із СДН та 7 собак із СХВ), які подавали до Ветеринарної медичної навчальної лікарні Техаського університету A&M гостру, негеморагічну або геморагічну діарею (визначається як тривалість діареї 3,5; для функціональних генів та їхніх конкретних ортологів KEGG поріг оцінки LDA встановлено> 2,5. LEfSe є у вільному доступі в Інтернеті в рамках робочого процесу Galaxy [26, 27].

Коротколанцюгові жирні кислоти

Концентрації SCFA у фекаліях перевіряли на нормальність і порівнювали між кожною групою за допомогою U-тесту Манна-Уітні. Потім SCFA, які були виявлені суттєво різними між групами, корелювали з диференційовано багатими бактеріальними групами (тобто кореляцією рангу Спірмена; JMP 10, SAS software Inc.).

Нецілена метаболоміка сироватки та сечі

Файли Waters raw були перетворені у формат netCDF, і XCMS [28] виявлення піків, вирівнювання часу утримання та групування функцій виконувались як на низьких, так і на високих каналах енергії зіткнення (MS та MSe). Набори даних були розділені після вирівнювання, нормалізовані до загального витягнутого іонного сигналу, усереднені за допомогою ін'єкційного повторення, і описаний раніше робочий процес idMS/MS був застосований до всіх важливих особливостей для генерації невибіркових спектрів MS/MS (idMS/MS) для пошуку в бібліотеці та ідентифікація сполуки [29]. Для ідентифікації спектрів було проведено пошук відтворених спектрів idMS/MS у базі даних NIST ‘12 MS/MS, Metlin та Massbank. Спектрам idMS/MS, які відповідають спектрам MS/MS бази даних, присвоєно рівень ідентифікації 2 рівня довіри [30]. Для сечі концентрації сполуки в кожному зразку сечі нормалізували до концентрації креатиніну в сечі і виражали як співвідношення. Сироватка нормалізувалась за обсягом. Після попередньої обробки даних було проведено аналіз основних компонентів та однофакторний аналіз за допомогою веб-інструменту обробки метаболомічних даних MetaboAnalyst 2.0 [31, 32].

Результати

Аналіз послідовності

Конвеєр аналізу дав 297 315 послідовностей якості для 19 проаналізованих зразків (середнє значення ± стандартне відхилення [всіх зразків] = 9013 ± 1203). Рис. 1 ілюструє криву розрідження для спостережуваних видів (підрахунок усіх унікальних оперативних таксономічних одиниць (ОТУ)). Всі показники альфа-різноманітності зведені в таблицю 1. Види видів значно зменшились у собак з гострою діареєю (р = 0,0218). Індекс Шеннона суттєво знизився у собак з AD та NHD порівняно із здоровими собаками (p = 0,0033 та p Рис. 1. Аналіз розрідження послідовностей генів 16S рРНК, отриманих із зразків калу собак.

Рядки представляють середнє значення, а стовпчики помилок - стандартні відхилення. Аналіз проводили на випадково вибраній підгрупі з 6900 послідовностей на зразок. NHD = гостра негеморагічна діарея; AHD = гостра геморагічна діарея.

Мікробні спільноти

Ділянки PCoA (рис. 2) на основі незважених відстаней Unifrac показали значні відмінності між здоровими собаками та собаками з AD (ANOSIM; p = 0,0040). Крім того, собаки з НХД та собаки з АГС суттєво відрізнялись від здорових собак (ANOSIM; p = 0,0020 для обох). Однак різниці в мікробних спільнотах не було між собаками з геморагічною та негеморагічною діареєю. На основі розміру ефекту LDA (LEfSe), Clostridium spp. був суттєво асоційований з АД, тоді як Prevotella spp., Blautia spp., Faecalibacterium spp., Eubacterium spp. та некласифіковані роди в наступних сім'ях: Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Clostridia, Ruminococcaceae та Coprobacillaceae були суттєво пов'язані зі здоровими собаками (рис. ). Для ілюстрації цих змін була використана теплова карта на рис.

Сині квадратики = здорові собаки, зелені кружечки = гостра негеморагічна діарея (NHD), а червоні трикутники = гостра геморагічна діарея (AHD); ANOSIM для здорових собак проти собак з АД (NHD та AHD разом узятих), p = 0,0040; та ANOSIM для NHD або AHD проти здорових собак, p = 0,0020 для обох.

Групи різно поширені між здоровими собаками та собаками з гострою діареєю. Червоні смужки представляють бактеріальні групи, пов’язані з собаками з гострою діареєю, тоді як зелені смуги - групи бактерій, пов’язані зі здоровими собаками.

Здорові = здорові собаки; NHD = гостра негеморагічна діарея; AHD = гостра геморагічна діарея. "Неклас." позначає некласифікований рід у відповідних таксонах.

У таблиці 2 та на рис. 5А узагальнено відмінності у групах бактерій між групами захворювань. Послідовності, що належать до типу Bacteroidetes, значно зменшувались у собак з АД порівняно зі здоровими собаками (p = 0,0280). Послідовності, що належать до роду Faecalibacterium та некласифікованого роду в межах Ruminococcaceae, суттєво зменшились у собак з БА порівняно зі здоровими собаками (p = 0,0319 та 0,0368 відповідно). Послідовності, що належать до роду Clostridium, були значно збільшені у собак з АД порівняно зі здоровими собаками (p = 0,0476). Не було виявлено відмінностей між собаками з геморагічною та негеморагічною гострою діареєю при оцінці бактеріальних груп.

Гостра діарея = обидві групи разом (NHD та AHD). Стовпчики представляють середнє значення для кожної групи. Значення P скориговані на основі коефіцієнта брехливих відкриттів Бенджаміні та Хохберга.

Кількісна ПЛР

Чисельність Clostridium perfringens суттєво зросла у собак з АД (медіана log ДНК [діапазон]: 7 [5,8–7,5]) порівняно зі здоровими собаками (медіана log ДНК [діапазон]: 4,6 [3–6,1]; p = 0,0088) . Clostridium perfringens також суттєво збільшився у підгрупи собак з AHD (медіана log ДНК [діапазон]: 7,1 [6,9–7,4]) порівняно зі здоровими собаками (p 2,5). З гострою діареєю були пов'язані наступні шляхи: розпад бензоату в рамках біодеградації/метаболізму ксенобіотиків, ліпідний обмін, двокомпонентна система в передачі сигналу, джгутиковий збір/білки рухомості бактерій/хемотаксис бактерій в межах рухливості клітин та метаболізм. Зі здоровими собаками були пов’язані такі шляхи: метаболізм метану/окисне фосфорилювання в межах енергетичного метаболізму та шаперони/каталізатори, що складаються, при сортуванні/деградації складок.

H .__ = Здоровий, A .__ = гостра негеморагічна діарея, R .__ гостра геморагічна діарея.

Коротколанцюгові жирні кислоти

Масляна кислота, оцтова кислота та пропіонова кислота виражались у відсотках від загальної кількості концентрацій SCFA в калі (рис. 7). Частка пропіонової кислоти суттєво зменшилася у собак з АД (медіана [діапазон]: 12% [0-25%]) порівняно зі здоровими собаками (медіана [діапазон]: 30% [20-44%]; р = 0,0033) . На відміну від цього, частка масляної кислоти була значно збільшена у собак з АД (медіана [діапазон]: 12% [8–26%]) порівняно зі здоровими собаками (медіана [діапазон]: 6% [4–8%]; p = 0,0048). Суттєвих відмінностей у загальній концентрації SCFA або BCFA в калі (мкмоль/г сухого калу) не спостерігалося між групами собак (таблиця S3).

Кола = здорові собаки; Квадрати = гостра діарея в обох групах (NHD та AHD). Стовпчики представляють середнє значення для кожної групи. Значення P скориговані на основі коефіцієнта брехливих відкриттів Бенджаміні та Хохберга.

Співвідношення між SCFA та бактеріальними групами

Позитивну кореляцію спостерігали між пропіоновою кислотою та некласифікованим родом всередині Ruminococcaceae, а також Faecalibacterium (ρ = 0,8377 [p = 0,0042] та ρ = 0,6725 [p = 0,0332] відповідно) (рис. 8). Було виявлено, що масляна кислота має негативну кореляцію з некласифікованим родом всередині Ruminococcaceae (ρ = -0,8265 [p = 0,0027]. Крім того, пропіонова кислота негативно корелювала з Lactobacillus (ρ = -0,8333 [p = 0,0424]).

А) Співвідношення між масляною кислотою та окремими бактеріальними групами. Б) Співвідношення між пропіоновою кислотою та окремими бактеріальними групами.

Метаболіти сироватки та сечі

Ділянки PCA не показали кластеризації в профілях метаболітів сироватки та сечі (рис. 9 та 10 відповідно) між здоровими собаками та собаками з гострою діареєю. Загалом у сироватці було виявлено 82 унікальних сполуки, тоді як у сечі - 362 унікальних сполуки. З цих сполук жодна з них не зазнала значних змін після коригування для багаторазового порівняння в будь-якому з аналізованих типів зразків. Однак у сироватці крові некореговані значення р показали, що концентрація кінуренової кислоти в сироватці крові значно зменшилася у собак з гострою діареєю порівняно зі здоровими собаками (р = 0,0048). На додаток до цього порівняння було порівняно співвідношення між концентрацією кінуренової кислоти (K) та триптофану (T) у сироватці крові здорових собак та собак із гострою діареєю. Співвідношення K/T значно зменшилось у собак з гострою діареєю (p = 0,0036).

А) Принциповий компонент аналізу компонентів, де червоні крапки представляють собак з гострою діареєю, тоді як зелені крапки представляють здорових собак. Еліпси показують 95% розподіл довіри для кожної групи. Б) Відносна концентрація кінуренової кислоти, триптофану та їх відношення один до одного в сироватці крові (р = 0,0048, 0,8282 та 0,0036; відповідно).

А) Принциповий компонент аналізу компонентів, де червоні крапки представляють собак з гострою діареєю, тоді як зелені крапки представляють здорових собак. Еліпси показують 95% розподіл довіри для кожної групи. Б) Відносна концентрація 2-метиліндолу та 5-метокси-1Н-індол-3-карбальдегіду в сироватці крові (р = 0,0185 та 0,0330 відповідно).

У сечі некореговані значення р показали, що концентрації 2-метил-1Н-індолу та 5-метокси-1Н-індол-3-карбальдегіду значно знижувались у собак із гострою діареєю порівняно зі здоровими собаками (р = 0,0185 та 0,0330, відповідно).