Межі в клітинній неврології

Нейронні клітини

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Роль нервово-судинного блоку у нейродегенерації Переглянути всі 15 статей

Редаговано
Енг-Кінг Тан

Національний інститут неврології (NNI), Сінгапур

Переглянуто
Хаджіме Хірасе

Університет Копенгагена, Данія

Фаріда Еллал

Helmholtz Zentrum München, Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HZ), Німеччина

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

гранична

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

Короткий звіт про дослідження СТАТТЯ

  • 1 Кафедра фізіології та неврології, Нейрогенетичний інститут Зілха, Медичний факультет Кека, Університет Південної Каліфорнії, Лос-Анджелес, Каліфорнія, США
  • 2 Відділ нейробіології, Інститут біологічних досліджень, Белградський університет, Белград, Сербія

Вступ

Правильна робота мозку залежить від надходження кисню та поживних речовин через мозковий кровотік (CBF). Нейроваскулярне зчеплення, унікальний механізм контролю CBF в мозку ссавців, забезпечує швидке збільшення швидкості CBF і доставки кисню до активованих структур мозку (Kisler et al., 2017a). Перицити - це периваскулярні муральні клітини, які огортають капіляри мозку. Вони розташовані центрально в нервово-судинній одиниці, колекції різних типів клітин, яка на рівні капілярів мозку включає перицити, ендотеліальні клітини, астроцити та нейрони (Kisler et al., 2017a). Наша група та інші показали, що перицити відіграють життєво важливу роль у регуляції CBF (Bell et al., 2010; Tachibana et al., 2018; Nikolakopoulou et al., 2019; Nortley et al., 2019), нервово-судинне зчеплення (Peppiatt et, 2006; Hall та ін., 2014; Biesecker та ін., 2016; Mishra та ін., 2016; Kisler та ін., 2017b; Cai та ін., 2018; Rungta та ін., 2018; Nortley та ін. ., 2019) та цілісність гематоенцефалічного бар’єру (BBB) ​​(Armulik et al., 2010; Bell et al., 2010; Daneman et al., 2010).

Раніше вивчені моделі вродженої дефіциту перицитів покладаються або на знижену біодоступність ендотеліального фактора росту-тромбоцитів (PDGF-BB; Armulik et al., 2010; Keller et al., 2013), або на успадковані у всьому світі рецептори фактора росту, що походять від тромбоцитів - Дефіцит β (PDGFRβ) у перицитах (Bell et al., 2010; Daneman et al., 2010; Nikolakopoulou et al., 2017). Pdgfrb-дефіцитні миші розвивають прогресивну, але повільну втрату перицитів з часом, пов'язану зі зниженням CBF та порушенням регуляції, що в кінцевому підсумку призводить до дисфункції нейронів, оскільки вони старіють, що може зайняти місяці (Bell et al., 2010; Kisler et al., 2017b; Montagne et al., 2018). Хоча ми раніше показували, що помірні втрати перицитів у Росії Pdgfrb мишей з дефіцитом перицитів призводить до роз'єднання нервово-судинної системи та зменшення доставки кисню, що передує пізніше нейрональним змінам (Kisler et al., 2017b). Використання в природних умовах техніка лазерної абляції, інше дослідження показало, що гостра поодинока перицитова абляція призводить до локальної тимчасової втрати судинного тонусу та розширення капілярів (Berthiaume et al., 2018). Однак жодне з цих досліджень не вивчало вплив швидкої та глобальної втрати перицитів мозку на гемодинамічні реакції, оскільки це може відбуватися при деяких гострих та хронічних неврологічних порушеннях (Sweeney et al., 2018a, b, 2019).

Щоб розмежувати зміни нервово-судинного зчеплення з аспектами розвитку втрати перицитів та визначити вплив глобальної гострої втрати перициту на нервово-судинне зчеплення, ми використовували нещодавно розроблену мишачу модель пеліцитоспецифічної абляції для швидкого виснаження перицитів з мозку живих мишей (Nikolakopoulou та ін., 2019). Ми припустили, що швидка втрата покриву капілярного перициту призведе до швидких аберантних гемодинамічних реакцій на нейрональний стимул.

Матеріали і методи

Тварини

Мишей розміщували в пластикових клітках на 12-годинному світловому циклі з ad libitum доступ до води та стандартна лабораторна дієта. Усі процедури були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Університеті Південної Каліфорнії з рекомендаціями Національного інституту охорони здоров'я. В експериментах використовували тварин обох статей віком 2–3 місяці. Усі тварини були рандомізовані для отримання інформації про генотип. Всі експерименти були засліплені: оператори, відповідальні за експериментальні процедури та аналіз даних, були засліплені і не знали про розподіл груп протягом експериментів.

Мишей Pericyte-CreER, які експресують Cre рекомбіназу спеціально в перицитах після індукції лікування тамоксифеном (TAM), генерували за допомогою методу подвійного промотору, що поєднує конструкцію Pdgfrb-Flp, яка експресує рекомбіназу Flp під контролем промотору Pdgfrb (Foo et al. ., 2006; Cuttler et al., 2011) та конструкція Cspg4-FSF-CreER, що несе касету Frt-Stop-Frt-CreER під контролем промотора Cspg4 (Zhu et al., 2008, 2011), як ми вже описали раніше (Nikolakopoulou et al., 2019). Цих мишей схрещували з мишами iDTR (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA #: 007900) для Cre-залежної експресії рецептора дифтерійного токсину (DT) (DTR; від simian Hbegf; Buch et al., 2005) у перицитах. Тамоксифен (TAM) вводили внутрішньочеревно (ip) мишам (40 мг/кг щодня) протягом 7 днів для індукції експресії DTR. Через два тижні після закінчення лікування ТАМ, 2-3 місяці Pericyte-CreER; iDTR мишам вводили i.p. 0,1 мкг DT (Sigma – Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США # D0564) або транспортний засіб на день протягом 10 днів поспіль, як ми повідомляли раніше (Nikolakopoulou et al., 2019). Тварин вивчали на 0, 3, 6 та 9 день лікування ДТ або лікування носієм, включаючи лазерну допплерівську флоуметрію (LDF), зображення власного оптичного сигналу (IOS) та покриття перицитів) та 3 дні після DT або транспортного засобу (LDF, IOS візуалізація, покриття перицитом, нейрональна реакція за допомогою чутливого до напруги барвника (VSD), судинна щільність).

Імуногістохімія

Для визначення покриття перицитом було реконструйовано максимум проекційних z-стеків 10 мкм (площа 640 × 480 мкм), а площі, зайняті CD13-позитивними (перицит) і лектин-позитивними (ендотелієм) флуоресцентними сигналами на судинах 3 тканини мозку.

Черепне вікно

Черепні вікна імплантували, як описано раніше (Kisler et al., 2017b, 2018). Коротко кажучи, спочатку тваринам знеболювали 100 мг/кг кетаміну і 10 мг/кг ксилазину і поміщали на грілку (37 ° C). Череп миші був міцно закріплений у стереотаксичній оправі (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). Високошвидкісна стоматологічна бормашина (наконечник FST 19007-05, Fine Science Tools Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США) була використана для розмежування черепного вікна діаметром близько 5 мм над соматосенсорною корою, а для щипців 45 ° вийміть шматок черепа. Гельфоам (Pharmacia and Upjohn Company, Каламазу, Массачусетс, США) був негайно застосований для контролю будь-яких черепних або дуральних кровотеч. Потім на тверду мозкову оболонку накладали стерильний покривний скляний скляний 5-міліметровий скляний матеріал і заклеювали клеєм на основі ціаноакрилату.

Лазерно-доплерівська флоуметрия (ЛДФ)

Реакції CBF на стимуляцію задніх кінцівок у знеболених мишей (1% ізофлуран) визначали за допомогою лазерно-доплерівської флоуметрії, виміряної через черепне вікно. Кінчик лазерно-доплерівського зонда (Transonic Systems Inc., Ітака, Нью-Йорк, США) був стереотаксично розміщений на 0,5 мм над черепним вікном. CBF реєстрували з соматосенсорної області кори задньої кінцівки після електричної стимуляції задньої кінцівки за допомогою стимулу довжиною 60 с (7 Гц, тривалість імпульсу 2 мс). Відсоток збільшення CBF внаслідок стимуляції було отримано шляхом віднімання базового рівня CBF від максимального значення, досягнутого під час стимулювання, і в середньому за три випробування на мишу. Для відповіді CBF на застосування ацетилхоліну зонд LDF був стереотаксично розміщений над центром відкритого черепного вікна (центр при AP = -1,5 мм, L = 2 мм). Ацетилхолін (10 мкМ, Sigma – Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) надливали над відкритим вікном, і відповіді реєстрували, як ми повідомляли раніше (Kisler et al., 2017b; Nikolakopoulou et al., 2019).

Власна візуалізація оптичного сигналу (IOS)

IOS були зображені через черепне вікно над задньою кінцівкою в соматосенсорній корі, як ми вже описали раніше (Kisler et al., 2017b, 2018). Під анестезією ізофлурану, встановленою на 1%, зображення знімали з частотою 30 мс/кадр за допомогою 1/2-дюймової камери CCD MiCAM02-HR (SciMedia; 2 × на 184 × 124 пікселі; 1 піксель = 16,5 мкм) із супровідним BV_ANA програмне забезпечення для придбання. Зображення були зроблені під зеленим світлодіодним джерелом світла 530 нм та зібрані через смуговий фільтр 522/36 нм (Chroma). Контралатеральна задня кінцівка стимулювалася короткочасною механічною вібрацією тривалістю 300 мс. Отримані набори зображень фільтрували низькі частоти при частоті 2 Гц, і базові лінії коригували на будь-який дрейф за допомогою програмного забезпечення BV_ANA. Курси часу сигналу оцінювали, використовуючи ROI радіуса 10 пікселів, вибрані в області пікової зміни сигналу таким чином, що області не включали жодних великих видимих ​​судин і були принаймні на 30 мкм від будь-яких великих судин. Часові курси будували за допомогою Igor Pro 6 та аналізували за допомогою Igor Pro 6 та GraphPad Prism 8. Псевдокольорові зображення для презентації створювались у ImageJ.

Зображення з чутливим до напруги (VSD)

Статистичний аналіз

Розміри зразків розраховували за допомогою nQUERY, припускаючи двосторонній альфа-рівень 0,05, 80% потужності та однорідні дисперсії для зразків, що підлягають порівнянню, із середнім значенням та загальним стандартним відхиленням для різних параметрів, оціненими на основі наших попередніх досліджень (Kisler et al., 2017b; Nikolakopoulou et al., 2017, 2019; Montagne et al., 2018). Дані представлені як середнє значення ± SEM. Для порівняння між двома групами, an F-тест був проведений для визначення схожості дисперсій між групами, які статистично порівнюються, а статистична значимість була проаналізована двостороннім студентом t-тест. Для множинних порівнянь використовували тест Брауна – Форсайта для визначення схожості дисперсій між групами та односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA), за яким слідували Бонферроні або Тукі post hoc тест використовували, як зазначено в легендах рисунків, для перевірки статистичної значущості за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 8. A P-значення менше 0,05 вважалося статистично значущим. Коефіцієнт кореляції та значущість Пірсона були розраховані за допомогою двостороннього тесту в програмному забезпеченні GraphPad Prism 8.

Результати

Для вивчення впливу гострої та глобальної втрати перициту на нервово-судинне зчеплення ми використовували нещодавно розроблену нами індуковану перицитоспецифічну лінію миші Cre (pericyte-CreER; Nikolakopoulou et al., 2019), схрещену до мишей iDTR, що несуть Cre-залежний рецептор токсину дифтерії людини (DTR; Buch et al., 2005; pericyte-CreER; iDTR), як ми вже повідомляли раніше (Nikolakopoulou et al., 2019). Лікування перициту-CreER; iDTR миші з тамоксифеном (TAM) індукують експресію DTR конкретно в перицитах (а не в будь-яких інших типах клітин), а подальше лікування DT веде виключно до загибелі клітин перициту, як повідомлялося раніше (Nikolakopoulou et al., 2019). Дефіцит нервово-судинного зчеплення оцінювали за допомогою LDF та IOS візуалізації реакцій CBF на подразник задніх кінцівок через 0, 3, 6 та 9 днів DT або лікування носієм транспортного засобу та 3 дні після DT або носія (Рисунок 1A). Покриття перицитом визначали через 0, 3, 6 і 9 днів лікування ДТ і через 3 дні після ДТ або транспортного засобу, тоді як вимірювання ВСД нейрональних реакцій потенціалу мембрани та щільності капілярних капілярів кори оцінювали через 3 дні після ДТ або лікування носієм (Малюнок 1А).

Фігура 1. Абляція кортикальних перицитів із мозку дорослої миші призводить до гострого порушення регуляції нервово-судинного зчеплення. (A) Схема протоколу ін’єкції перициту-CreER; iDTR миші з тамоксифеном (TAM; 40 мг/кг щодня протягом семи днів поспіль), дифтерійним токсином (DT; 0,1 мкг на день протягом 10 днів поспіль) або носієм, а також моменти часу, коли мозковий кровотік (CBF) реагує на стимул, що вимірюється за допомогою лазерної доплерівської флоуметрії (ЛДФ) та зображення власного оптичного сигналу (ІОС), нейрональної реакції на подразник та вимірювання щільності капілярів. (B) Репрезентативні зображення конфокальної мікроскопії CD13-позитивного покриття перицитом лектин-позитивних ендотеліальних профілів в області задньої кінцівки кори S1 на 3, 6 та 9 дні введення ДТ або транспортного засобу та через 3 дні після ДТ або транспортного засобу. Бар = 20 мкм. (C) Кількісна оцінка втрати покриття перицитів на капілярах (Ключові слова: нервово-судинне зчеплення, гостра абляція перициту, мозковий кровотік, капіляр, лазерна допплерівська флоуметрія, внутрішня візуалізація оптичного сигналу, візуалізація чутливого до напруги барвника

Цитата: Kisler K, Nikolakopoulou AM, Sweeney MD, Lazic D, Zhao Z і Zlokovic BV (2020) Гостра абляція кортикальних перицитів призводить до швидкого нейросудинного розчеплення. Спереду. Клітинка. Невроски. 14:27. doi: 10.3389/fncel.2020.00027

Отримано: 26 жовтня 2019 р .; Прийнято: 29 січня 2020 р .;
Опубліковано: 14 лютого 2020 року.

Енг-Кінг Тан, Національний інститут неврології (NNI), Сінгапур

Хаджіме Хірасе, Університет Копенгагена, Данія
Фаріда Хеллаль, Інститут досліджень інсульту та деменції (ISD), Німеччина

* Листування: Беріслав Васильович Злокович, [email protected]

† Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу та мають перше авторство