Гепатоцелюлярне човгання та рециркуляція сорафенібу-глюкуроніду залежать від Abcc2, Abcc3 та Oatp1a/1b

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Анотація

Вступ

У цьому дослідженні ми мали на меті зрозуміти процеси, що лежать в основі солювання глюкуроніду гепатоцитів сорафенібу, виведення жовчі та рециркуляцію кишечника за допомогою моделей in vitro та in vivo, а отже, з’ясувати механізми, що сприяють міжіндивідуальній фармакокінетичній мінливості сорафенібу.

Матеріали і методи

Везикулярний транспорт in vitro

Везикули з клітин Sf9 (Life Technologies), що експресують миші Abcc2 (mAbcc2), щури Abcc2 (rAbcc2), людини ABCC2 (ABCC2), людини ABCC3 (ABCC3) або людини ABCC4 (ABCC4), інкубували з сорафенібом (10 мкмоль/л; Хемі) Tek) або SG (10 мкмоль/л) протягом 5 хвилин у присутності або відсутності АТФ (4 ммоль/л) або рифампініну (100 мкмоль/л), потім лізують з 0,1 моль/л HCl і аналізують за допомогою рідинної хроматографії. тандемна мас-спектрометрія (LC/MS-MS; посилання 20). АТФ-залежний транспорт сорафенібу та СГ визначали шляхом віднімання АМФ-залежного транспорту від АТФ-залежного транспорту, причому обидва виражалися в пмоль/хв/мг, після нормалізації для неспецифічного транспорту, який спостерігався у контрольних везикулах. Експерименти з поглинанням проводили при концентрації 10 мкмоль/л, що еквівалентно середнім концентраціям сорафенібу в стаціонарному стані, досяжних у дорослих та дітей, які отримували 400 мг або 200 мг/м 2 двічі на день (9, 21).

Тварини

Мишей Abcc4 -/- на фоні C57BL/6 генерували та вирощували власними силами в Дитячій дослідницькій лікарні Сент-Джуд (Мемфіс, Теннессі), а мишей Abcc2 -/- на фоні FVB надавав Taconic. Усі інші нокаут-штами на тлі FVB були створені та вирощені в Інституті раку Нідерландів (Амстердам, Нідерланди). Аналіз ПЛР у режимі реального часу продемонстрував, що експресія відповідних транспортерів лікарських засобів суттєво не змінилася в жодному з цих нокаутних штамів (Додаткова таблиця S1). Тому була виключена можливість серйозних компенсаторних змін у експресії транспортера, що впливають на інтерпретацію результатів. Abcc2 -/- щури на фоні Спрег-Доулі були отримані від Sage Labs. Мишей і щурів утримували в середовищі з контрольованою температурою з 12-годинним світловим циклом і отримували стандартну дієту та воду за бажанням. Експерименти були схвалені інституційними комітетами з догляду та використання тварин Дитячої дослідницької лікарні Сент-Джуд та Нідерландського інституту раку.

Фармакокінетичні дослідження плазми

Фармакокінетика сорафенібу та SG у мишей дикого типу та Abcc2 -/-. Профілі концентрації плазми у часі (A та D) та співвідношення печінки до плазми (B та E) сорафенібу та SG відповідно у самок мишей дикого типу та Abcc2 -/-. Сорафеніб призначали перорально у дозі 10 мг/кг. Печінку брали через 2 та 7,5 години після введення сорафенібу (n = 4 на групу). Концентрації в печінці (CL) нормалізували до відповідних концентрацій у плазмі (Cp). C та F, співвідношення концентрації сорафенібу та SG у жовчі до плазми крові у мишей дикого типу та Abcc2 -/-. Сорафеніб (10 мг/кг) вводили перорально за 30 хвилин до початку збору жовчі (N = 3 дикого типу; N = 2 миші Abcc2 -/-). Жовч збирали протягом 2 годин. Дані представляють середнє значення ± SE.

ABCC2 опосередковує жовчовиділення SG

Щоб визначити, чи спостерігаються ці фенотипи також у інших видів, фармакокінетику сорафенібу оцінювали у щурів дикого типу та Abcc2 -/-. Дефіцит Abcc2 у щурів призвів приблизно до 2-кратного збільшення рівня плазми як сорафенібу (рис. 3А), так і сорафенібу-N-оксиду (рис. 3Б). Однак несподівано SG не виявлено в плазмі або жовчі ні щурів дикого типу, ні щурів Abcc2 -/- (рис. 3C). Дослідження метаболізму ex vivo показали, що порівняно з мишами та людьми (9) мікросомам печінки щурів не вистачає значної здатності утворювати СГ (рис. 3D). Ці результати вказують на те, що щур є неадекватною моделлю для фармакокінетики сорафенібу у людини. Більше того, участь ABCC2 у транспорті незміненого сорафенібу може набувати дедалі більшого значення, коли глюкуронізація дефектна, що відповідає останнім клінічним даним (10). У сукупності дані вказують на те, що жовчовиділення СГ в основному опосередковується ABCC2 і тому є важливим фактором, що визначає фармакокінетику СГ.

На синусоїдальний транспорт СГ впливає дефіцит Abcc2 та Abcc3

Потім розподіл сорафенібу оцінювали у мишей Oatp1a/1b; Abcc2 -/- та Oatp1a/1b; Abcc2; Abcc3 -/-. Відповідно до наших висновків на одиничних мишах Abcc2 -/- ми виявили, що делеція Abcc2 у поєднанні з делецією Oatp1a/1b призвела до дуже великого збільшення плазмової експозиції SG порівняно з мишами дикого типу (у 909 разів), але також порівняно з мишами Oatp1a/1b -/- (12,7-кратні; рис. 4D; Додаткова таблиця S2). Через 2 години рівень SG в печінці був у 1,8 рази вищим у мишей Oatp1a/1b; Abcc2 -/- порівняно з мишами дикого типу (рис. 4Е). В результаті сильно підвищеного рівня SG в плазмі крові співвідношення печінки до плазми зменшилось у всіх нокаутованих мишей-транспортерів порівняно з мишами дикого типу (рис. 4F). Ці висновки підтверджують важливу роль Abcc2 у жовчовиділенні SG, і що видалення Abcc2 на додаток до дефіциту Oatp1a/1b призводить до значного збільшення синусоїдальної екструзії цього метаболіту назад у кровообіг.

Ми виявили, що вплив плазми SG зменшився на 30% у мишей Oatp1a/1b; Abcc2; Abcc3 -/- у порівнянні з мишами Oatp1a/1b; Abcc2 -/- (рис. 4D). Вплив Abcc3 на печінку залишався помітним із 1,5-кратним збільшенням абсолютних рівнів СГ у печінці (рис. 4E) та 1,7-кратним збільшенням співвідношення печінка до плазми (рис. 4F) через 2 години в Oatp1a/1b; Abcc2; Abcc3 -/- миші порівняно з мишами Oatp1a/1b; Abcc2 -/-. Рівень сорафенібу у плазмі та печінці суттєво не змінився у цих штамів (додаткові мал. S3C та S3D). У сукупності ці висновки вказують на те, що Abcc3 має чіткий вплив на синусоїдальну секрецію SG, і в поєднанні з раніше продемонстрованою здатністю Oatp1a/1b захоплювати SG через синусоїдальну мембрану, це може призвести до "стрибка гепатоцитів" цього кон'югату препарату. Однак існують і інші частково надлишкові синусоїдальні транспортери витоку для СГ, які обмежують абсолютний вплив дефіциту Abcc3 у мишей, можливо, особливо при високому рівні гепатоцитів SG, спричиненому порушенням виведення жовчі через Abcc2.

Декон'югація SG за допомогою кишкових β-глюкуронідаз миші

Для того, щоб оцінити долю SG, що виділяється Abcc2 в жовч, ми далі проводили інкубаційні дослідження вмісту кишечника (сліпої кишки) мишей на основі висновку, що потрапляючи в кишечник, SG може служити субстратом для бактеріальних ферментів β-глюкуронідази. які виробляються бактеріями, які зазвичай населяють кишечник (30). Видалення глюкуронідної групи в СГ β-глюкуронідазою генерує джерело вуглецю для бактерій, і в процесі цього СГ знову активується до фармакологічно активного сорафенібу. Протягом 6-годинного періоду в неочищеній суспензії вмісту сліпої кишки ми спостерігали залежне від часу зниження рівня SG та відповідне збільшення сорафенібу (рис. 5А). Попередня обробка зразків сліпої кишки при температурі 65 ° C призвела до скасування утворення сорафенібу, що вказує на те, що декон’югація СГ - процес, опосередкований ферментами. Крім того, ми виявили, що утворення сорафенібу з СГ зменшилося приблизно в 3 рази у зразках сліпої кишки у мишей, які попередньо обробляли неоміцином для усунення кишкової флори (рис. 5В; посилання 31). Цей висновок узгоджується з припущенням, що β-глюкуронідази, що продукуються кишковою мікробіотою, відповідають за декон’югацію СГ із сорафенібом.

Утворення сорафенібу із СГ кишковим вмістом миші. A і B, утворення сорафенібу при ex vivo інкубації вмісту сліпої кишки миші FVB з SG (2 мкмоль/л) з попередньою обробкою теплом або без нього (65 ° C; A), або після обробки мишей сольовим розчином або пероральним неоміцином 200 мг/кг давали двічі на день протягом 5 днів (n ≥ 4/група; B). Дані нормували до концентрації SG при t = 0 і представляють середнє значення ± SE. С, концентрація сорафенібу у плазмі крові у мишей, попередньо оброблених пероральним неоміцином (200 мг/кг), яким вводили двічі на день протягом 5 днів. У день взяття проби крові SG (10 мг/кг) вводили перорально. Сорафеніб не був виявлений у плазмі крові лише через 8 годин після введення СГ. Всі тварини були самками FVB-мишей. Дані представляють середнє значення ± SE.

На закінчення, це дослідження показує, що синусоїдальна петля човна з печінки до крові для SG формується Oatp1a/1b, Abcc3, і, ймовірно, іншим транспортером синусоїдального потоку. Таким чином, на додаток до ендобіотичних метаболітів глюкуроніду, таких як BG, ксенобіотики, які зазнають печінкової глюкуронізації, також можуть піддаватися одному і тому ж процесу стрибків гепатоцитів, залежно від відносної спорідненості цих сполук до синусоїдальних та каналікулярних транспортерів, таких як Abcc2 (рис. 6) . Враховуючи широку субстратну специфічність цих транспортерів, ми сподіваємось, що наші висновки матимуть значення для багатьох інших ксенобіотичних глюкуронідів. Ці висновки також свідчать про те, що фактори, які заважають гепатоцелюлярному човнику, екскреції жовчовивідних шляхів та/або кишковій декон'югації СГ, матимуть значний вплив на системний вплив сорафенібу та, ймовірно, сприятимуть значній фармакокінетичній мінливості, що спостерігається при застосуванні сорафенібу та інших інгібіторів тирозинкінази. глюкуронізація та ентерогепатична рециркуляція, такі як регорафеніб (33).

Перестрибування гепатоцитів та рециркуляція SG. Після перорального прийому сорафеніб потрапляє в гепатоцити за допомогою не повністю визначених транспортних механізмів, включаючи носії типу OATP1B та OCT1, і піддається метаболізму, опосередкованому CYP3A4, до сорафеніб-N-оксиду (s-N-оксиду) та кон'югації UGT1A9 з утворенням SG. Після кон'югації SG екстенсивно виділяється в жовч за допомогою процесу, який в основному опосередковується ABCC2. У фізіологічних умовах частина внутрішньоклітинної СГ секретується ABCC3 і принаймні ще одним транспортером назад у кров, звідки вона може знову потрапляти в гепатоцити нижче за течією носіїв типу OATP1B1 (Oatp1a та Oatp1b у мишей). Ця петля секреції та зворотного захоплення може запобігти насиченню ABCC2-опосередкованої жовчовиділення у вихідних гепатоцитах, забезпечуючи тим самим ефективну елімінацію жовчі та детоксикацію гепатоцитів. Потрапляючи в жовч, SG потрапляє в просвіт кишечника, де служить субстратом для ще невідомих бактеріальних β-глюкуронідаз (βGLU), які продукують сорафеніб, який згодом піддається кишковому всмоктуванню і відновлює системний кровообіг.

Розкриття потенційного конфлікту інтересів

С. Мані є членом консультанта/дорадчої ради Symberix. A.H. Schinkel повідомляє, що отримував іншу комерційну підтримку для лабораторії Schinkel внаслідок комерційного розподілу деяких штамів мишей, використаних у цьому дослідженні. Інші автори не розкривали жодного потенційного конфлікту інтересів.

Застереження

За вміст несуть виключну відповідальність автори та не обов'язково відображають офіційні погляди фінансових установ.

Внески авторів

Концепція та дизайн: С. Дурмус, С. Мані, А. Спарребум, С.Д. Бейкер, А.Х.Шінкель

Розробка методології: А. Васильєва, Е. Вагенаар, С. Ху, А.А. Гібсон, С. Бейкер

Збір даних (надані тварини, придбані та керовані пацієнти, надані засоби тощо): А. Васильєва, С. Дурмус, Л. Лі, Е. Вагенаар, С. Ху, А.А. Гібсон, С. Бейкер

Аналіз та інтерпретація даних (наприклад, статистичний аналіз, біостатистика, обчислювальний аналіз): А. Васильєва, С. Дурмус, С. Ху, А.А. Гібсон, Дж. К. Панетта, С. Мані, А. Спарребум, С.Д. Бейкер, А.Х.Шінкель

Написання, рецензування та/або перегляд рукопису: А. Васильєва, С. Дурмус, С. Ху, А.А. Гібсон, Дж. К. Панетта, С. Мані, А. Спарребум, С.Д. Бейкер, А.Х.Шінкель

Адміністративна, технічна або матеріальна підтримка (тобто звітування або організація даних, побудова баз даних): Е. Вагенаар, С. Ху, А.А. Гібсон, Дж. К. Панетта, С. Мані

Нагляд за дослідженням: С.Д. Бейкер, А.Х.Шінкель

Інше (генерація ідей): С. Мані

Грантова підтримка

Цю роботу підтримали, зокрема, Американські ліванські сирійські асоційовані благодійні організації (ALSAC), грант на підтримку онкологічного центру USPHS 3P30CA021765 (S.D. Baker) та гранти NCI 5R01CA138744 (S.D. Baker) та 1R01CA161879 (S. Mani).

Витрати на публікацію цієї статті були частково сплачені за рахунок оплати сторінок. Тому ця стаття повинна бути цим позначена як реклама відповідно до 18 U.S.C. Розділ 1734 виключно для зазначення цього факту.

Подяка

Автори дякують доктору Джону Д. Шуцу за надання мишей C57BL/6 Abcc4 -/-.