Функціональні химери p53, що містять повтор Gly-Ala вірусу Епштейна – Барра, захищені від індукованого Mdm2- та HPV-E6 протеолізу

Відредаговано Пітером М. Хоулі, Гарвардська медична школа, Бостон, Массачусетс, та затверджено 16 листопада 2001 р. (Отримано для огляду 18 червня 2001 р.)

Анотація

Функціональна інактивація білка-супресора пухлини p53 прискореним убіквітин/протеасомним залежним протеолізом є поширеною подією при прогресуванні пухлини. Протеасомна деградація гальмується повторенням Глі-Ала (GAr) ядерного антигену-1 вірусу Епштейна – Барра, який діє як передавальний елемент на різних протеасомних субстратах. Ми демонструємо, що химери p53, що містять домени GAr різної довжини та положення всередині білка, захищені від протеолізу, індукованого убигітиновими лігазами мишачого подвійного хвилини 2 та білком, асоційованим з E6, але все ще убіквітіновані та зберігають здатність взаємодіяти з убіквітин-зв'язуючим S5a субодиниця протеасоми. Химери GAr трансактивують гени-мішені р53, індукують зупинку клітинного циклу та апоптоз і демонструють поліпшену активність пригнічення росту в пухлинних клітинах з порушеною ендогенною активністю р53.

Інактивація p53 високим рівнем Mdm2 або HPV E6 забезпечує очевидну перевагу росту in vivo (13, 14), припускаючи, що терапевтично активний білок p53 повинен протистояти активності цих лігаз. У цьому контексті слід підкреслити, що Mdm2 та E6-AP належать до окремих сімейств лібізатів убиквітину (15). Нещодавно було показано, що Mdm2 являє собою убиквітин-лігазу з кільцем, що зв'язується з транскрипційним доменом трансактивації p53 (16). На відміну від цього, E6-AP взаємодіє з ДНК-зв'язуючим доменом і є класичним прикладом убиквітин-лігази домену HECT (гомологія до кінця E6-AP C) (6). Ці явні відмінності між двома лігазами означають, що одночасне врятування p53 від опосередкованої Е6 та Mdm2 деградації може бути досягнуто лише шляхом націлювання на загальні подальші події на шляху деградації.

Цікаву можливість досягти цієї мети може запропонувати нещодавно відкритий модулятор убиквітин-залежного протеолізу, повтор Gly-Ala (GAr) ядерного антигену-1 вірусу Епштейна-Барра (EBV) (EBNA1). Цей білковий домен перешкоджає протеасомній обробці EBNA1 (17), подовжуючи період його напіввиведення та скасовуючи представлення епітопів EBNA1 до основних комплексів гістосумісності класу I-обмежених CD8 + Т-лімфоцитів (18, 19). GAr діє як цис-діючий передавальний елемент на різних протеасомних підкладках (17, 20). Проміскуйність ефекту означає, що GAr може бути в змозі протидіяти активності широкого спектру лібіоз убиквітину, забезпечуючи тим самим привабливий інструмент для регулювання протеолізу багатьох субстратів, що становлять потенційний інтерес для генно-трансферної терапії (21).

Тут ми повідомляємо про генерацію набору химер p53-GAr, які демонструють поліпшену стійкість до індукованої Mdm2- та E6 деградації в аналізах котрансфекції та в клітинних лініях людських пухлин із прискореним протеолізом ендогенного p53. Химери p53-GAr ефективно врятовуються від залежності від убихитину/протеасоми деградації, що призводить до підвищення рівня стійкого функціонально активного p53.

Матеріали і методи

Побудова химер p53-GAr.

Аналіз культури тканин, трансфекції та формування колоній.

Лінії остеосаркоми людини Saos-2 [p53 null (26),] та U2OS [p53 дикого типу, надмірна експресія Mdm2 (13)], а також лінії раку шийки матки людини HeLa (p53 дикого типу, HPV18 позитивні), CasKi та SiHa [p53 дикого типу, позитивні до HPV16 (14, 27)] підтримувались у модифікованому середовищем Дульбекко Іскове (Life Technologies, Grand Island, NY), доповненому 10% FCS. Перехідні трансфекції субконфлюентних моношарів проводили за допомогою ліпофектаміну (Life Technologies). Для аналізів формування колоній 1,9 105 трансфікованих клітин U2OS розщеплювали через 16 год після трансфекції (8000 клітин на лунку) у середовищі, що містить 0,5 мг/мл генетицину (Sigma). Кількість життєздатних колоній підраховували через 2 тижні відбору.

Вестерн-блот-аналіз.

Загальні клітинні екстракти фракціонували за допомогою SDS/PAGE, переносили на нітроцелюлозні мембрани Protran BA85 (Schleicher & Schuell) і зондували первинними моноклональними антитілами миші anti-p53 (D07, Dako) або моноклональними антитілами миші p21 WAF/CIP1 (Transduction Laboratories), Лексінгтон, Кентуккі). Після інкубації з відповідними кон’югованими з пероксидазою вторинними антитілами комплекси візуалізувались за допомогою посиленої хемілюмінесценції (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech). Для визначення оборотності білка клітини, що швидко переходять, інкубували з циклогексимідом (Sigma). Денситометрію проводили за допомогою персонального денситометра SI (Молекулярна динаміка).

Проточна цитометрія та імуноцитохімія.

Проточний цитометричний аналіз проводили за допомогою проточного цитометра FACSort (Becton Dickinson) та програмного забезпечення Cellquest. Для аналізу клітинного циклу клітини фіксували та фарбували мишачим анти-p53 антитілом D07 та міченим FITC анти-мишачим антитілом (Dako) за допомогою набору Cytofix/Cytoperm (PharMingen) перед інкубацією з йодидом пропідуму (Sigma). Для фарбування за допомогою імунофлюоресценції клітини фіксували в 4% параформальдегіді, а потім інкубували протягом ночі з моноклональним антитілом миші anti-FLAG (M5, Sigma).

Аналізи зниження глутатіон-S-трансферази (GST).

ORF S5a та S8 ампліфікували ПЛР з бібліотеки кДНК людських лейкоцитів (CLONTECH) та клонували у pGEX-5X-1 (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech). Злиті білки GST-S5a та S8 очищали від штаму Escherichia coli BL-21 (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech). Клітини HeLa, тимчасово трансфіковані FLAG p53 або FLAG p53-GA239/C, лізували при 4 ° C протягом 12 год у буфері для лізису (1% дигітоніну/50 мМ NaCl/50 мМ Tris, pH 7,6), що містить суміш інгібіторів протеази (Sigma) та 20 мМ N-етилмалеїміду (Sigma). Лізати очищали центрифугуванням протягом 20 хв при 4 ° C, 15000 × g і розбавляли в зв'язуючому буфері (50 мМ Tris, рН 7,6/50 мМ NaCL/0,01% Triton X-100/10% гліцерину). Два мікрограми злитого білка GST іммобілізували на 10 мкл гелю глутатіон Сефароза 4В (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech) та інкубували з лізатами клітин HeLa. Після п’ятикратного промивання при 4 ° С в буфері для зв’язку зразки ресуспендували в буфері зразків SDS для поділу за допомогою SDS/PAGE та імуноблотування антитілом проти p53 D07.

Результати

Вираз химер p53-GAr.

Був побудований набір химер, що містять GAr, для дослідження впливу повторення на оборот і функцію білка-супресора пухлини p53. GAr довжиною 239 аа, отриманий із природного ізоляту EBV (28), був вставлений у кінцеву точку p53 (рис. 1А). Крім того, на N або C кінці p53 було введено коротший 25-аа-довгий GAr або контрольний 25-аа-відрізок гліцину.

Експресія химер p53-GAr у p53-негативних клітинах Saos-2. (A) Схематичне зображення химер, позначених FLAG (F) p53, що містять N- або C-кінцеві вставки GAr або GGr. (B) Екстракти транзиторно трансфікованих клітин Saos-2 досліджували методом Вестерн-блоттінгу моноклональним антитілом, специфічним для дикого типу p53. Позначені маркери молекулярної ваги.

Експресія химер була досліджена шляхом трансфекції в р53 негативної остеосаркоми лінії Saos-2. Найвищі рівні експресії регулярно виявляли в клітинах, трансфікованих химерами p53-GA239/C, а потім клітинами, трансфікованими p53-GA25/N або p53-GA25/C, тоді як експресія була постійно нижчою у клітинах, трансфікованих p53 дикого типу або химери p53-GG25/N та p53-GG25/C (рис. 1B).

GAr захищає p53 від Mdm2- та HPV-E6-індукованого протеолізу.

Експресія p53 була досліджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу клітин Saos-2, котрансфікованих плазмідами, що експресують різні химери p53 та убіквітин-лігазу Mdm2. Як і очікувалось, рівні стійкого стану р53 дикого типу різко знизились у присутності Mdm2 залежно від дози (рис. 2 А і В). Вставка 25-залишкового GAr призвела до помірного захисту від індукованої Mdm2 деградації, тоді як більш драматичний ефект був досягнутий шляхом вставки повтору довжиною 239 залишків, узгоджуючись з нашим попереднім спостереженням, що ефект GAr є довжиною залежний (23). У клітинах, що експресують сильно стабілізований p53-GA239/C, була виявлена чітка драбина з регулярно розташованими високомолекулярними видами, що свідчить про те, що химери все ще піддаються повсюдному індукуванню Mdm2. Відповідно до уявлення про те, що убиквітінований p53 швидко руйнується протеасомою, ця сходинка не виявлялася в клітинах, що експресують молекулу дикого типу.

Химери p53-GAr стійкі до деградації, спричиненої Mdm2- та HPV-E6. (А) Клітини Saos-2 трансфікували 100 нг зазначеної плазміди, що кодує р53, разом з 0, 100, 200 або 400 нг плазміди, що експресує Mdm2. Загальні клітинні екстракти, зібрані через 16 год, піддавали Вестерн-блот-аналізу за допомогою моноклонального анти-p53 антитіла. Вказана сходи високомолекулярних видів p53. (B) Денситометрія вестерн-блотів, показана в А. (C) Клітини Saos-2 трансфікували 100 нг зазначеної кодуючої р53 плазміди та 400 нг контрольної плазміди pcDNA3 (-) або HPV16-E6-експресії (+) . Деталі експерименту, як у А. Зазначені маркери молекулярної маси. (D) Субодиниці протеасомної кришки 19S людини S5a та S8 експресувались у бактеріях у вигляді злитих білків GST, іммобілізованих на глутатіон Сефарозі, та аналізували в аналізах зв’язування колонок з лізатами клітин HeLa, трансфікованих FLAG p53 дикого типу (0) або ПРАПОР p53, що містить 239-aa GAr (239). Вестерн-блотинг досліджували моноклональним антитілом проти p53. Показана коротка експозиція 10% вхідного сигналу (ліворуч). Позначено види p53, які взаємодіють з S5a, та високомолекулярні види p53.

Далі ми перевірили, чи химери р53 також стійкі до протеолізу, індукованого білком Е6 ВПЛ16. Котрансфекція клітин Saos-2 диким типом p53 разом із 4-кратним надлишком HPV16-E6 призвела до різкого зниження експресії p53, тоді як химери p53-GAr, що містять повтори довжиною 25 або 239 aa, зазнавали лише незначного впливу (Рис. 2C). Стабілізація не була спричинена GAr-індукованим припиненням взаємодії між E6 та p53, оскільки злитий білок GST-E6 однаково добре взаємодіяв з химерами p53- та GAr, що містять дикий тип, у випадаючих аналізах (дані не показано) . Посилений ефект повторень у цій експериментальній установці, ймовірно, пояснюється наявністю фізіологічних рівнів лігази E6-AP порівняно з величезною надмірною експресією Mdm2.

Химери p53-GAr зберігають функціональні властивості дикого типу p53.

Щоб дослідити, чи зберігають химери GAr транскрипційну активність p53 дикого типу, клітини Saos-2 котрансфікували плазмідами, кодуючими p53, і плазмідою-репортером, що містить ген EGFP, під контролем елемента, що реагує на p53. Експресія p53 дикого типу призвела до дозозалежної активації транскрипції, тоді як EGFP не індукувався в клітинах, що експресують ДНК-зв'язуючий мутант p53 R273H (рис. 3А) (30). Химери, що містять GAr довжиною 25 аа, були такими ж активними, як p53 дикого типу, тоді як химера p53-GA239/C демонструвала порушення транскрипційної активності, яка досягала ≈55% ефекту p53 дикого типу при найвищій досліджуваній концентрації плазміди. Ген p53-мішені p21 WAF/CIP1 регулюється в клітинах Saos-2, трансфікованих плазмідами, що експресують p53 або p53-GAr, додатково підтверджуючи трансактиваційну компетентність химер (рис. 3B).

Mdm2 може інактивувати p53, зв'язуючись з доменом активації транскрипції (31). Тому ми запитали, чи стабільні химери p53-GAr можуть залишатися транскрипційно активними в присутності Mdm2. Вираження Mdm2 зменшило індукцію p21 WAF1/CIP1 на p53, p53-GA25/C та p53-GA239/C (рис. 3C). Однак стабільно більш високі рівні p21 WAF1/CIP1 були виявлені в клітинах, що експресують химери p53-GAr, що було більш очевидним за наявності 2- та 4-кратного надлишку плазміди Mdm2.

P53 контролює проліферацію та виживання клітин, викликаючи зупинку клітинного циклу G1/G2 та апоптоз (1). Тому ми запитали, чи зберегли химери p53-GAr ці функціональні властивості p53. Експресія p53 або химер у наших загальновживаних клітинах Saos-2 призвела до зменшення відсотка клітин у G2/M та збільшення клітин у G1 (рис. 3D). Ефект був специфічним, оскільки клітини, трансфіковані мутантом p53 R273H, демонстрували розподіл клітинного циклу, ідентичний розподілу p53-негативної популяції (дані не наведені). Однак апоптоз індукувався лише у невеликій частці р53-експресуючих клітин. Повідомлялося, що, хоча низька експресія р53 індукує зупинку клітинного циклу, для індукції апоптозу необхідні більш високі рівні експресії (32). Отже, ми звернулися до іншого клону Saos-2, який постійно забезпечує вищу ефективність трансфекції. Крім того, p53 дикого типу та химера p53-GA239 були субклоновані в експресуючу EGFP плазміду, щоб забезпечити пряме виявлення трансфікованих клітин. Експресія p53 викликала більш ніж у 2 рази збільшення відсотка апоптотичних клітин порівняно з порожнім вектором EGFP, і подальше збільшення спостерігалося в клітинах, що експресують химеру p53-GA239 (рис. 3E).

Химери p53-GAr стабілізуються в клітинах з прискореним оборотом p53.

У багатьох типах пухлинних клітин, які експресують p53 дикого типу, було продемонстровано прискорений протеоліз p53. Тому ми запитали, чи химери p53-GAr стабілізовані та функціонально активні також у пухлинних клітинах, які несуть онкогенні штами ВПЛ, або експресують рівні Mdm2, достатні для інактивації ендогенного білка. Аналіз обороту p53 у HPV18-позитивній лінії карциноми шийки матки HeLa продемонстрував, що, тоді як ектопічний p53 дикого типу мав період напіввиведення лише трохи довший ніж ≈20 хв, визначений для ендогенного p53, химер, що містять 25- або 239-aa-довжину Домени GAr мали значно довший період напіввиведення (рис. 4А). Подібні результати були отримані у двох клітинних лініях раку шийки матки, позитивних до HPV16, CasKi та SiHa (дані не наведені). Химери GAr демонстрували значно подовжений період напіввиведення також у клітинній лінії остеосаркоми U2OS (рис. 4B), що виражає високий рівень Mdm2 (13).

Химери p53-GAr стабільні в пухлинних клітинах з прискореною деградацією p53. Клітинна лінія клітин карциноми шийки матки HPV18-E6 HeLa (A) або надмірно виражена Mdm2 клітинна лінія остеосаркоми U2OS (B) була тимчасово трансфікована FLAG p53 або зазначеними химерами FLAG p53-GAr. Через 16 год клітини інкубували з 60 мкг/мл циклогексиміду, а клітинні екстракти збирали після зазначеного часу інкубації. Експресія p53 була виявлена за допомогою Вестерн-блоттінгу моноклональним анти-p53 антитілом. Вказані ендогенні продукти p53 (кінцеві) та позаматкові продукти FLAG p53.

Аналіз формування колонії

Обговорення

Висновок про те, що GAr може захистити p53 від деградації, індукованої двома лібізами убиквітину, які розпізнають незалежні сигнали націлювання, свідчить про те, що інгібуючий домен може втручатися в загальну подію після убіквітації. Це було зроблено раніше з висновку, що химери EBNA4-GAr ефективно убиквітуються у вільній від клітин системі (17) та за рахунок накопичення убиквітінованих химер IκBα-GAr у клітинних екстрактах, оброблених інгібіторами ферментів деубіквітації (20). Примітно, що, незважаючи на те, що всебіквітація цих субстратів могла бути незахищеною, в клітинних лізатах регулярно виявлялися лише некон'юговані химери, що призвело нас до припущень, що химери GAr можуть потрапляти у вічний цикл повсюдного вживання і деубіквітінації, який може виключити взаємодія з протеасомою. Спільно експресуючи химери p53-GAr з великою кількістю Mdm2, ми спостерігали накопичення поліубіквітінованих GAr, що містять білки в клітинах. Це накопичення підтримує уявлення про те, що інгібуючий домен діє на подію постубіквітації.

На закінчення ми зараз подали переконливі докази того, що EBV GAr може діяти як селективний інгібітор убиквітин-залежного протеолізу, який протидіє широкому діапазону цілеспрямованих сигналів та убиквітинових лігаз. Демонстрація того, що химери p53-GAr залишаються функціонально компетентними, свідчить про те, що інсерція вірусного повтору може забезпечити зручну стратегію для стабілізації найрізноманітніших білків, що становлять потенційний інтерес для генно-замісної терапії.

Подяка

Ми вдячні за чудову технічну підтримку Маріанни Джелн, Ентоні Чена та Нілоофара Расті. Ми дякуємо Карен Х. Вусден, Берту Фогельштейну та Володимиру Дж. Бикову за добрі подарунки реагентів. Це розслідування було підтримане грантами, наданими Шведським онкологічним товариством, Шведським фондом стратегічних досліджень, Шведською дослідницькою радою, Petrus och Augusta Hedlunds Stiftelse та Інститутом Каролінської. С.Х. та Н.П.Д. були підтримані стипендіями, наданими Програмою підготовки та мобільності Європейської Комісії (ERBFMRXCT960026). А.Л. є членом спільного магістра/доктора філософії. Програма між Медичною академією Латвії (AML) та Інститутом Каролінської (KAMP).

Виноски

↵ § Кому слід адресувати запити на передрук. Електронна пошта: nico.dantumamtc.ki.se .

Цей документ було подано безпосередньо (Доріжка II) до офісу PNAS.