Межі в мікробіології

Гриби та їх взаємодія

Редаговано

Гектор Мора Монтес

Університет Гуанахуато, Мексика

Переглянуто

Правен Р. Джувваді

Університет Дьюка, США

Френк Ебель

Мюнхенський університет імені Людвіга Максиміліана, Німеччина

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

Ключова лабораторія Цзянсу для мікробів та функціональної геноміки, Центр досліджень мікробіології інженерії та технології Цзянсу, Коледж наук про життя, Нарцинський університет, Нанкін, Китай

Правильний час та розташування цитокінезу/септації є вирішальним для росту і конідації гіфів у Aspergillus nidulans. Компоненти мережі ініціювання септації (SIN) - це локалізований сигнальний каскад збереженого тіла шпиндельного полюса (SPB) та кінцевий кіназний комплекс SidB-MobA, який повинен локалізуватися на SPB у цьому шляху, щоб викликати септацію/цитокінез. Регуляторна субодиниця фосфатази PP2A-ParA була визначена негативним регулятором, здатним інактивувати SIN. Однак мало відомо про те, як ParA регулює шлях SIN і чи регулює ParA процес утворення перегородки, впливаючи на локалізовані SPB білки SIN. У цьому дослідженні за допомогою RNA-Seq та генетичних підходів ми виявили новий позитивний регулятор септації, передбачуваний білок, що організовує мітотичне веретено, та дріжджовий гомолог Mzt1 MztA, який діє антагоністично по відношенню до PP2A-ParA, щоб координувати регуляцію SPB-локалізованих білків SIN SidB-MobA під час септації. Ці висновки свідчать про те, що регулятори, фосфатаза PP2A-ParA та MztA протидіють септаційній функції, ймовірно, шляхом збалансування полімеризації та деполімеризації мікротрубочок на SPB.

Вступ

Крім того, SPB також служить центром, що організовує мікротрубочки (MTOC), щоб розпочати полімеризацію мітотичного веретена та забезпечити механізм зародження для регулювання прикріплення та динаміки мікротрубочок та встановлення полярності мікротрубочок (Zekert et al., 2010; Takeshita та Fischer, 2011; Kilmartin, 2014; Wieczorek et al., 2015). Основним регулятором зародження мікротрубочок (МТ) є γ-тубуліновий кільцевий комплекс (γ-TuRC), який обмежує мінусові кінці МТ і сприяє спрямованому зародженню МТ. Таким чином, МТ - це динамічні полімери, що переходять між полімеризацією та деполімеризацією (Xiong and Oakley, 2009; Suri et al., 2014; Walia et al., 2014). Більше того, сигнали, що передають локалізовані SPB білки SIN через каскад для запуску цитокінезу, потребують просторового та часового контролю МТ-залежних подій клітинної реструктуризації (Robinson and Spudich, 2004; Rankin and Wordeman, 2010; Zhou et al., 2010; Ngo et al ., 2016). У людській тканині виявлено білок, який називається білком, що організовує мітотичне веретено (MOZART1), який взаємодіє з γ-TuRC, щоб сприяти полімеризації мікротрубочок, а потім породити розгалужені мікротрубочки (Hutchins et al., 2010; Teixidó-Travesa та ін., 2010; Cukier та ін., 2017). Однак відомості про те, чи впливає головний регулятор γ -TuRC зародження МТ на цитокінез, все ще обмежені.

У цьому дослідженні за допомогою RNA-Seq та генетичних підходів ми ідентифікували новий позитивний регулятор септації MztA, який діє антагоністично ParA, щоб координувати регуляцію SPB-локалізованих білків SIN SidB-MobA під час септації в ниткоподібному грибі A. nidulans.

Матеріали і методи

Штами, середовища та умови культури

Список A. nidulans штами та олігонуклеотиди, використані у цьому дослідженні, наведені в таблицях 1, 2. YAG (5 г/л екстракту дріжджів + 1 мл/л мікроелемента + 20 г/л глюкози), YUU (YAG + 1,2 г/л уридину + 1,1 г/Л урацилу), MMPGR (50 мл/л солі + 10 мл/л гліцерину + 0,5 мг/л піридоксину + 2,5 мг/л рибофлавіну + 1 мл/л мікроелемента), MMPGRTUU (MMPGR + 1,2 г/л уридину + 1,1 г/л урацилу + 11,9 г/л треоніну) та MMPPGRTUU (MMPGRUU із 100 мМ п-амінобензойної кислоти). Ці носії були описані в попередніх роботах (Gupta et al., 1976; Käfer, 1977). Умови росту, схрещування та умови індукції для alcA(сторекспресія) -приводів була такою, як описано раніше (Liu et al., 2003). Надмірна експресія мічених генів під контролем alcA промотор індукували треоніном (Zhong et al., 2014). Для цього використовувались стандартні процедури трансформації ДНК A. nidulans (Османі та ін., 1988).

Таблиця 1. Aspergillus nidulans штами, використані в цьому дослідженні.

Таблиця 2. Праймери, використані в цьому дослідженні.

Кількісний аналіз ПЛР у реальному часі

Конідії парА-мутант із надмірною експресією та батьківський дикий тип (TN02A7) культивували в MMPGRTUU протягом 18 год при 37 ° С за допомогою роторного шейкера при 220 об/хв, а потім зібрані висушені гіфи подрібнювали до дрібнодисперсного порошку у присутності рідкого азоту. Загальну РНК екстрагували за допомогою TRIzol (Roche), дотримуючись інструкцій виробника. Зразки обробляли ДНКазою I (TaKaRa), і кДНК генерували за допомогою набору синтезу кДНК iScript Select (Bio-Rad). ПЛР у режимі реального часу проводили за допомогою швидкісного термоциклера ABI (Applied Biosystems), а продукти реакції виявляли за допомогою SYBR зеленого (TaKaRa). ПЛР проводили 10-хвилинною стадією денатурації при 95 ° C з подальшим 40 циклами 95 ° C-30 с, 60 ° C-30 с, 72 ° C-30 с. Рівні розшифровки розраховували порівняльним методом КТ та нормалізували щодо експресії гена актину в A. nidulans (Alam et al., 2012; Long et al., 2016). Інформація про праймери наведена в таблиці 2.

Побудова мутантних штамів

Для конструкцій надвиражених вищезгаданих п'яти генів у фоновому режимі парА-надмірно виражаючись, A. nidulans AnpyroA ген, що підбирається харчовим маркером, ампліфікували парою праймерів NotI-pyroA-5 '/ SpeI-pyroA-3'. Тоді AnpyroA фрагмент клонували у вектор відновлення pBARGPE1 за допомогою одношагового набору для клонування ClonExpress II (VazymeTM, C112-02), цей штам позначали pBARGPE1-1, який містить AngpdA промоутер. Використовуючи гДНК як шаблон, фрагменти ORF цих п’яти генів ампліфікували пар праймерів mztA-ClaI-5 ′/mztA-ClaI-3 ′, pdbA-ClaI-5 ′/pdbA -ClaI-3 ′, pdbA-SmaI- 5 ′/pdbA-SmaI-3 ′, pamA-ClaI-5 ′/pamA-ClaI-3 ′, cdc5A-ClaI-5 ′/cdc5A-ClaI-3 ′ відповідно, і згодом були клоновані в pBARGPE1-1. Отримані відповідні плазміди трансформували в ОЕ:парА процідити.

Для створення alcA (p) -gfp-mobA конструкція синтезу, фрагмент 594 bp мобА ампліфікували з геномної ДНК TN02A7 за допомогою праймерів mobA-NotI-5 ′/mobA-XbaI-3 ′ (див. таблицю 2), а потім мобА клонували у відповідні сайти pLB01, отримуючи pLB-mobA (Liu et al., 2003). Ця плазміда була трансформована в штам отримання R21. Гомологічна рекомбінація цієї плазміди в мобА локус повинен призвести до злиття N-кінцевого зеленого флуоресцентного білка (GFP) з продуктом цілого мобА ген під контролем alcA промоутер. Цей штам згадували як alc (p) -mobA-GFP. Для генерації ОЕ:парА мобА−GFP, OE:mztA мобА−GFP та OE:парА OE:mztA мобА- Штами GFP, alc (p) -mobA-GFP був схрещений з OE:парА, OE:mztA та OE:парА OE:mztA мутантів, відповідно.

Мікроскопія та обробка зображень

Виділення РНК для північного аналізу

Результати

Ідентифікація пригнічувачів ParA в септації та конідації

Фігура 1. Ідентифікація супресорів парА в септації та конідації. (A) Відносний рівень мРНК mztA, pdbA, pdaA, pamA, і cdc5A, відповідно, використовуючи RT-PCR-аналізи в реальному часі в парА-надмірно виражений мутант і батьківський дикий тип (TN02A7). Ці два штами культивували в рідкому середовищі MMPGRTUU при 37 ° C при 220 об/хв протягом 18 год. Виміряну кількість мРНК у кожному з оброблених зразків нормалізували з використанням значень C T, отриманих для внутрішнього контрольного актину (AN3696.4). (B) Фенотипова характеристика mztA, pdbA, pdaA, pamA, і cdc5A видалення мутантів у фоновому режимі парА-надмірно виражений мутант та батьківський дикий тип (TN02A7) відповідно. Всі штами культивували на твердому середовищі MMPGRTUU протягом 2,5 днів. (C) Морфології колоній надвиражених мутантів для mztA, pdbA, pdaA, pamA і cdc5A гени у фоновому режимі парА-надмірно виражений мутант. Всі штами культивували на твердому середовищі MMPGRTUU протягом 2,5 днів.

Малюнок 2. Гіфальні морфології mztA, pdbA, pdaA, pamA, і cdc5A видалення (A) та їх надмірне вираження (B) на задньому плані парА-надмірно експресуючий мутант, культивований у рідкому середовищі MMPGRTUU і забарвлений Calcofluor білим (перегородками). Всі штами культивували при 37 ° C протягом 11 годин. Стрілки вказують місця розташування перегородок. Батончики, 10 мкм.

На відміну від цього, ми далі задавались питанням, чи може надмірне вираження цих п’яти генів врятувати хвору морфологію парА-надмірно виражений мутант. Потім ми надмірно виражали їх символом AngpdA-керується установчим промоутером у фоновому режимі парА-надмірна напруга. Діагностична ПЛР виявила ті споріднені штами, які були сконструйовані успішно (рис. S2). Примітно, надмірне вираження mztA значно відновив ОЕ:парА мутант до фенотипу з WT-подібним конідіацією та радіальним ростом гіфа, як показано на малюнку 1С. Для порівняння, надмірна експресія інших чотирьох генів не могла врятувати аконідіальну колонію до фенотипу дикого типу. Послідовно, ліквідні культурні спостереження показали, що ОЕ:mztA може врятувати дефект септації надмірно вираженого парА, в той час як між іншими чотирма штамами надмірної експресії та його батьківським штамом дикого типу не було явних відмінностей щодо септації (рис. Тому ці результати свідчать про це mztA працює як придушувач парА в септації та конідації в A. nidulans.

Дефекти септації та конідації, викликані надмірним вираженням парА Рятуються надмірним вираженням mztA залежно від дози

Зменшені перегородки в ΔmztA Придушуються видаленими парА

Малюнок 4. Аномальний розподіл перегородок в mztA делеційний мутант і рівні мРНК для mztA і парА гени на різних стадіях розвитку у дикого типу (TN02A7). (A) Порівняння розподілу перегородки в гіфальних клітинах між батьківським диким типом (TN02A7) та ΔmztA мутант. Ці два штами вирощували в середовищі MMPGRTUU при 37 ° С протягом 10,11 та 12 год. Перегородки фарбували Calcofluor білим. Стрілки вказують місця розташування перегородок. Батончики, 10 мкм. (B) Кількісні дані для відстані між перегородками WT та ΔmztA мутант за однакових культурних умов і часу. Статистичну значимість визначали за тестом Стьюдента, с P Ключові слова: ParA, MztA, PP2A, супресор, септація, Aspergillus nidulans

Цитування: Jiang P, Zheng S and Lu L (2018) Мітотично-шпинделя, що організовує білок MztA опосередковує сигналізацію септації шляхом придушення регуляторної субодиниці білкової фосфатази 2A-ParA у Aspergillus nidulans. Спереду. Мікробіол. 9: 988. doi: 10.3389/fmicb.2018.00988

Отримано: 06 лютого 2018 р .; Прийнято: 27 квітня 2018 р .;
Опубліковано: 08 травня 2018 р.

Гектор Мора Монтес, Університет Гуанахуато, Мексика

Правен Рао Джувваді, Університет Дьюка, США
Френк Ебель, Мюнхенський університет Людвіга-Максиміліана, Німеччина