Екстракти листя женьшеню Panax проявляють ефект проти ожиріння у щурів із ожирінням з високим вмістом жиру

Сеуль Гі Лі

1 Департамент харчових наук та біотехнологій Національного університету Кюнгпук, Тегу 41566, Корея; moc.revan@974001gsl

Юн Чонг Лі

2 Департамент наук про життя університету Єуннам, Кьонсан 38541, Корея; ten.liamnah@7447-eeljy

Мён Хван Джанг

3 Науково-дослідний інститут женьшеню Пунгі Gyeong Buk A.R.E.S, Gyeongsangbuk-do Agricultural and Research and Extension Services, Daegu 41404, Корея; rk.aerok@jmnawh (M.-H.J.); rk.aerok@7711nowkrt (Т.Р.К.)

Тае Рьонг Квон

4 Відділ сільськогосподарських досліджень навколишнього середовища, Gyeongsangbuk-do Сільськогосподарські дослідження та розширення послуг, Тегу 41404, Корея

Джу-Ок Нам

1 Департамент харчових наук та біотехнологій Національного університету Кюнгпук, Тегу 41566, Корея; moc.revan@974001gsl

5 Інститут сільськогосподарських наук та технологій, Національний університет Кюнгпук, Тегу 41566, Корея

Пов’язані дані

Анотація

1. Вступ

Ожиріння є головною проблемою здорового стану населення та пов’язане із збільшенням захворюваності на метаболічні захворювання у всьому світі [1,2]. Це спричинено дисбалансом між споживанням енергії та витратами енергії, що утворює надмірну жирову тканину [3,4]. Маса жирової тканини може регулюватися процесом адипогенезу або диференціацією адипоцитів, який широко вивчався для лікування або профілактики ожиріння [5,6]. Хоча багато досліджень досліджували потенційні методи лікування ожиріння, розробка препаратів для тривалого лікування ожиріння виявилася не дуже успішною [7]. Тому стратегії профілактики ожиріння за допомогою здорових функціональних продуктів харчування вважаються важливими.

Корінь женьшеню традиційно використовується для профілактики та лікування різних захворювань понад 2000 років. Повідомляється, що екстракти коренів корейського женьшеню (Panax ginseng C.A. Meyer) виявляють антиадипогенну активність в адипоцитах 3T3-L1; Встановлено, що ці екстракти містять кількісно визначені кількості гінзенозидів, таких як гінзенозид Rg1, Re, Rf, Rb1 та Rc [8]. Однак надземні частини женьшеню не використовуються ефективно. Попередні дослідження повідомляли, що лист женьшеню багатий біоактивними сполуками і що вміст деяких гінзенозидів у ньому вищий, ніж у корінні [9]. Крім того, було показано, що екстракти стебла, листя та ягід американського женьшеню (Panax quinquefolium) виявляють активність проти ожиріння in vivo [10,11,12].

Попереднє дослідження продемонструвало, що у зрілих (зістарених) листках американського женьшеню вміст загальних гінзенозидів вищий, ніж у молодих листках [13]. У одномісячному листі загальний вміст гінзенозиду становив 1,33–2,64 г/100 г, тоді як у чотиримісячному листі загальний вміст гінзенозиду становив 4,14–5,58 г/100 г.

Однак бракує повідомлень про фармакологічні ефекти надземних частин корейського женьшеню порівняно з американським, а ефекти проти ожиріння екстрактів листя корейського женьшеню ще не досліджені.

Таким чином, ми вивчили вплив ожиріння екстрактів листя з корейського женьшеню на щурах із ожирінням, індукованих високим вмістом жиру (HFD). Крім того, порівнювали ефекти екстрактів старих та молодих листя. Результати показали, що екстракти листя корейського женьшеню мають проти ожиріння ефекти in vivo та in vitro; однак, механізми дії вважалися різними для екстрактів.

2. Матеріали та методи

2.1. Приготування екстрактів листя женьшеню

Екстракти листя женьшеню (трирічного віку) були надані Службою сільськогосподарських досліджень та розширення сільського господарства Кьонсангбук-до (Корея). У цьому дослідженні екстракти молодого та старого листя називають екстрактом зеленого листя (GL) та висушеного листя (DL) відповідно. Два різні типи листя збирали і сушили при 50 ° C протягом 24 годин. Потім зразки листя екстрагували дистильованою водою (співвідношення висушеного зразка/води 10: 3 (мас./Вага)) при 90 ° С протягом 72 год і зберігали при 4 ° С для подальшого використання.

2.2. Тварини

П'ятитижневі самці щурів Спрег-Доулі (SD) були придбані у компанії Hyochang Science (Корея). Після 1-тижневого періоду адаптації тварин випадковим чином розподіляли до наступних груп, кожна з яких складалася з семи тварин: (1) нормальний раціон (ND); (2) HFD; (3) добавки HFD + GL (3,3 мг/кг); та (4) добавки HFD + DL (3,3 мг/кг). Склад HFD наведено в таблиці S1, і всіх щурів підтримували протягом 12 годин циклу світло-темно. GL та DL вводили перорально кожного дня експериментального періоду. Після завершення лікування відбирали зразки крові та жирових тканин для подальшого аналізу. Усі протоколи, що стосуються експериментів на тваринах, були схвалені Інституційним комітетом з догляду за тваринами Національного університету Кюнгпук (номер затвердження: KNU 2017-13 та дата затвердження: 2 лютого 2017 р.).

2.3. Біохімічний аналіз

В останній день експериментів кров збирали в пробірки для збору сироватки і центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв для отримання супернатанту плазми. Рівні плазмових маркерів щодо нефротоксичності, гепатотоксичності та ліпідного профілювання визначали за допомогою автоматичного аналізатора.

2.4. Культура клітин та диференціація

Клітини преадипоцитів миші 3T3-L1 були придбані в Korea Cell Line Bank (KCLB, Сеул, Корея) та культивовані в модифікованому середовищем Eagle Dulbecco (DMEM; GIBCO, Grand Island, NY, USA), доповненому 10% бичачої телячої сироватки (BCS); GIBCO). Для індукування диференціації адипоцити 3T3-L1 культивували до злиття (позначений як День 0) протягом 2 днів, а середовище замінювали DMEM, що містить 10% фетальної бичачої сироватки (FBS; GIBCO) та розчину MDI (склад: 0,5 мМ IBMX, 1 мкМ DEXA, 0,125 мМ індометацину та 10 мкг/мл інсуліну) протягом 2 днів. Після цього клітини витримували в середовищах, доповнених 10% FBS та 10 мкг/мл інсуліну протягом 4 днів. Для вивчення антиадипогенних ефектів екстрактів клітини, що зазнали диференціації, обробляли GL та DL протягом усіх стадій диференціювання.

2.5. Аналіз масляного червоного O фарбування та тригліцеридів (TG)

Фарбування маслом червоного O (ORO) та аналіз TG проводили, як описано раніше [14]. Коротко кажучи, клітини, які зазнали диференціації у зрілі адипоцити, промивали, фіксували та фарбували розчином Олійного червоного О для виявлення крапель ліпідів. Всі зображення були отримані за допомогою мікроскопа (Leica, Wetzlar, Німеччина). Аналіз TG проводили згідно з інструкціями виробника.

2.6. Життєздатність клітин (аналіз МТТ)

Преадипоцити 3T3-L1 висівали на 96-лункові планшети та обробляли GL або DL у концентрації 0,15 або 0,3 мг/мл протягом 48 годин. Для вивчення впливу GL або DL на зрілі адипоцити клітини 3T3-L1 висівали та обробляли MDI та GL або DL протягом усього періоду диференціювання. В кінці обробки середовище видаляли і замінювали розчином МТТ (3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолію) та інкубували протягом 3 год при 37 ° С. Після інкубації обложений формазан розчиняли ізопропіловим спиртом (Duksan Pure Chemicals, Сеул, Корея).

2.7. Ланцюгова реакція зворотної транскрипції-полімерази (RT-PCR)

РНК виділяли за допомогою реагенту RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Японія). Додаткову ДНК синтезували за допомогою набору реактивів Prime Script RT (TaKaRa Bio) відповідно до протоколу виробника. Були розроблені специфічні праймери для щурів та мишей, які показані в таблиці S2. Експресія мРНК в адипоцитах 3T3-L1 та жирових тканинах епідидиму нормалізувалася до рівня β-актину та GAPDH відповідно за допомогою програмного забезпечення ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

2.8. Вестерн-клякса

Загальний білок екстрагували за допомогою буфера лізису PRO-PREP (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Корея), який містить інгібітори фосфатази та коктейль інгібітора протеази. Лізати центрифугували при 13000 об/хв протягом 15 хв. Зразки білка відокремлювали SDS-PAGE, переносили на мембрани нітроцелюлози, блокували з використанням 5% знежиреного знежиреного молока та інкубували протягом ночі при 4 ° C з антитілами проти PPARγ, LPL, aP2, адипонектину (Abcam, Cambridge, UK), C/EBPα (Технологія сигналізації клітин Беверлі, Массачусетс, США) та β-актин (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія, США).

2.9. Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± SD. Статистичне порівняння проводили за допомогою одностороннього ANOVA. Значення р Рисунок 1 А). Маса черевної та епідидимальної жирових тканин значно зменшилась у щурів HFD-GL та HFD-DL порівняно з масою щурів, що годували HFD (рис. 1 B). Крім того, щури HFD-GL та HFD-DL показали знижений коефіцієнт ефективності харчування, але відмінності не були суттєвими (Малюнок 1 С).