Довголанцюгові аналоги жирних кислот пригнічують пухлинний процес та прогресування молочної залози

Анотація

Вступ

Кетогенні дієти з обмеженим вмістом вуглеводів, збагачені жиром за рахунок вуглеводів, неодноразово повідомляли про придушення раку молочної залози (15, 16). Придушення пухлини кетогенними дієтами приписується обмеженню інсуліну та IGF1, що діють як фактори росту (розглянуто в посиланні 17), та обов’язковій вимозі злоякісних клітин до метаболітів, похідних глюкози (наприклад, нуклеотидів, NADPH), для забезпечення їх потреб у біомасі. (Ефект Варбурга, огляд у посиланні 18). Дійсно, рак молочної залози сприяє інсулінорезистентності/гіперінсулінемії, а сенсибілізатори інсуліну, що використовуються для лікування діабету 2 типу (наприклад, метформіну), виявляються ефективними для придушення пухлинного генезу загалом та раку молочної залози зокрема (19). В якості альтернативи, ефективність кетогенних дієт у придушенні пухлинного генезу може бути надалі властивою ефективності вільних/нестерифікованих довголанцюгових жирних кислот (LCFA), якщо дозволено досягти досить високих внутрішньоклітинних концентрацій. Обмеження вуглеводів дійсно може це дозволити, обмежуючи доступність гліцерин-3-фосфату та інсуліну, необхідних для етерифікації LCFA у ліпідні продукти (20).

Передбачувана притаманна ефективність нестерифікованого LCFA для придушення трансформації може бути змодельована аналогами MEDICA. Аналоги MEDICA (21) складаються з довголанцюгових, α, ω – діолових кислот [HOOC – C (α ′) - C (β ′) - Q – C (β) –C (α) –COOH, де Q являє собою довголанцюговий серцевинний елемент], заміщений в αα ′ (Mαα), ββ ′ (Mββ) та/або інших необов’язкових вуглецевих вуглецях. Аналоги MEDICA можуть бути тіоестерифіковані до відповідних CoA-тіоефірів, але вони не естерифікуються в ліпіди і не перетворюються в кераміди, тоді як заміни в положеннях αα або ββ ′ блокують їх β-окислення. Аналоги MEDICA переважно виводяться з жовчю у вигляді відповідних глюкуронідів. Таким чином, аналоги MEDICA можуть імітувати аллостеричну активність вільних/нестерифікованих LCFA, уникаючи при цьому їх ролі як субстратів для β-окислення або етерифікації в ліпіди. Більше того, аналоги MEDICA довели протидіабетичну гіполіпідемічну ефективність у серії моделей тварин із діабетом із ожирінням (22–24, 26), що викликало наш інтерес до вивчення ефективності кетогенної дієти та MEDICA в контексті раку молочної залози.

Матеріали і методи

Тварини та дієти

Імуногістохімія

Зразки пухлини молочної залози, закріплені у 4% забуференному формальдегіді, були вбудовані в парафін. Зрізи (5 мкм) депарафінізовували та регідратували за допомогою градуйованих розведень етанолу з подальшим варінням у 25 ммоль/л цитратного буфера, рН 7,4, при 115 ° C протягом 3 хвилин. Ендогенну пероксидазну активність блокували 3% перекисом водню. Потім зрізи інкубували з первинними антитілами, як зазначено, з подальшою інкубацією з пероксидазою хрону (HRP) або кон'югованими флуоресцентними вторинними антитілами (лабораторія Джексона). Зрізи, інкубовані HRP, були забарвлені гематоксиліном. Інтенсивність флуоресценції аналізували за допомогою конфокальної мікроскопії з використанням DAPI для візуалізації ядер (Zeiss LSM 710; Axio спостерігач Z1). Легкі вирізали і зафіксували у формаліні протягом ночі, а потім вклали парафін. Зрізи (5 мкм) фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) та аналізували за допомогою комп’ютерної мікроскопії (Ariol SL-50; Olympus BX61 Applied Imaging).

Клітинні культури

Первинні клітини MMTV-PyMT були виділені від 16-тижневих мишей MMTV-PyMT, як описано раніше (25). Клітини Met-1 (доктор Олександр Боровський, Центр порівняльної медицини, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія) та первинні клітини культивували в повному DMEM (Biological Industries), доповненому розчином пеніцилін-стрептоміцину, l -глютаміном та 10 % FCS з подальшим додаванням MEDICA, як зазначено. Кількісну проліферацію визначали за допомогою аналізу метиленового синього. Клітини Met-1, культивовані на 24 планшеті, трансфікували репортерною плазмідою M67-TATA-TK-LUC (1 мкг), експресійними плазмідами для конститутивного STAT3 (0,1 мкг) та для CMV – β-галактозидази (0,1 мкг), використовуючи jetPEI DNA трансфекційний реагент (26). Через 8 годин середовище змінювали і клітини обробляли протягом 24 годин за допомогою MEDICA, як зазначено. Активність люциферази, нормалізовану до β-галактозидази, вимірювали, як описано раніше (26). Клітини HCC1954 (ATCC CRL-2338) культивували в RPMI-1640 (Biological Industries), доповнену розчином пеніциліну-стрептоміцину та 10% FCS, і додавали MEDICA, як зазначено. Там, де вказано, клітини HCC1954 інфікували лентівірусними нокаут-конструкціями sh-c-Src, sh-STAT3 або плазмідами, що скремблюють (Sigma Mission), з подальшим відбором пуроміцину.

Клоногенний аналіз

Клітини відповідних експериментальних пластинок трипсинізували. Загалом 7500 клітин висівали на 60-мм пластину і давали змогу формувати колонії протягом 10 днів. Клітини фіксували 0,625% глютеральдегідом і фарбували метиленовим синім. Були підраховані колонії розміром понад 400 мкм.

Лізис клітин та вестерн-блот

Культивовані клітини зішкребали 1X буфером для лізису (50 ммоль/л Tris HCl рН 8,0, 1% Triton X-100, 1 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л EDTA, 150 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л NaPPi, 50 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л PMSF, 1 ммоль/л Na ванадат, 40 нмоль/л bpVfan і коктейль інгібітора протеази (Sigma), і центрифугували протягом 15 хвилин при 12500 об/хв. Заморожені зразки пухлини гомогенізували в лізисному буфері з використанням Polytron Концентрацію білка визначали за допомогою BCA (Thermo Scientific). Якщо не вказано інше, білкові лізати готували в буфері зразків SDS [62 ммоль/л Трис (рН 6,8), 2,3% SDS, 0,64 ммоль/л меркаптоетанолу, 10% гліцерину], піддані SDS-PAGE, електротрансферовані на нітратні мембрани целюлози (Schleicher & Schuell) і зондовані зазначеним першим антитілом, а потім міченим HRP другим антитілом. Там, де зазначено, білкові лізати готували в буфері зразків SDS, у якому відсутній меркаптоетанол. за допомогою ECL, а інтенсивність окремих смуг визначали за допомогою денситометрії Програмне забезпечення TINA 2.10.

Імунопреципітація

Клітини MET-1 інкубували, як зазначено. Після інкубації клітини один раз промивали в холодному PBS і лізували 50 ммоль/л Hepes (рН 7,4), 150 ммоль/л NaCl, 10% гліцерину, 1,5 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л EGTA, 1% тритону, 50 ммоль/л β-гліцеролфосфату, 25 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л Na-ванадату, 40 нмоль/л bpVphen, суміш інгібіторів протеази (Sigma) та 17,5 мг/мл октилу бета-D-глюкопіранозиду (Sigma). Лізати витримували на льоду протягом 30 хвилин і центрифугували при 12000 об/хв протягом 15 хвилин. Лізат 250 мкг інкубували протягом 4 годин з білком A/G гранулами (Santa Cruz Biotechnology), попередньо завантаженим зазначеним антитілом. Імунопреципітат промивали три рази промивним буфером [20 ммоль/л Hepes (рН 7,4), 150 ммоль/л NaCl, 0,1% Tx-100, 10% гліцерину], суспендували в буфері зразків SDS і кип'ятили протягом 8 хвилин. Імунопреципітовані білки аналізували за допомогою SDS-PAGE/Вестерн-блот.

qRT-ПЛР

РНК очищали від заморожених тканин миші за допомогою Total Kit РНК Mini Kit (Geneaid). РНК 0,5 мкг використовували як шаблон для синтезу кДНК із використанням зворотної транскриптази M-MLV (Invitrogen). ПЛР у режимі реального часу проводили (Rotorgene, Corbett Research) з використанням KAPA SYBR FAST qPCR MIX (Kapa Biosystems) із наступними праймерами (від 5 'до 3'): MMP9 (Fw: AACCTCCAACCTCACGGACAC, Rev: CTGCT-TCTCTCCCATCATCTGG); Е-кадгерин (Fw: TCATCATTGAGAGGGAGACAGGCT, Rev: TGGGTAAACTCTGGCCTGTTGTCA); Ezh2 (Fw: GACGATGATGGAGATGA-TCCAGATG, Rev: CCGAG-GTGGGCAAGTTTCTTTATC); PyMT (Fw: CTCCAACAGATCACCCGCACATACT, Rev: GCTGGTCTTGGTCGCTTTCTGGA-TAC). МРНК визначали кількісно, використовуючи метод ΔΔCt (27).

ІФА

Вміст VEGF у мишачих лізатах визначали, використовуючи набір Quantikine Mouse VEGF (R&D System) відповідно до інструкцій виробника.

Виробництво АФК

Виробництво активних форм кисню (АФК) визначали шляхом додавання 2,7 дихлорфлуоресцеїнадіацетату (DCF; 5 мкмоль/л) до відповідних культур клітин протягом останніх 15 хвилин інкубації. Клітини промивали один раз PBS і лізували 0,5% TX-100. Флуоресценцію DCF визначали шляхом аналізу збудження/випромінювання 485/530 нм. Виробництво пероксиду водню визначали шляхом інкубації відповідних середовищ для росту (без фенолу червоного) з HRP/Amplex Red (Invitrogen). Флуоресценцію визначали за допомогою аналізу збудження/випромінювання 560/590 нм. Співвідношення глутатіон/глутатіондисульфід (GSH/GSSG) визначали за допомогою аналізу GSH/GSSG-Glo (Promega) згідно з протоколом виробника.

Антитіла

Анти-β-казеїнові, анти-Ерк та анти-фосфо-Ерк (Tyr204) антитіла були отримані від Santa Cruz Biotechnology; анти-pHH3, анти-Akt, анти-фосфо-Akt (Ser473), анти-фосфо-c-Src (Tyr416), анти-фосфо-c-Src (Tyr527), анти-розщеплена каспаза-3, анти-фосфо- Антитіла FAK (Tyr925), антифосфо-p130CAS (Tyr910) були отримані від технології Cell Signaling Technology; анти-c-Src та анти-Ezh2 антитіла були від Millipore; анти-BrdUrd антитіло було від Thermo Scientific; анти-CD34 антитіло було з Cedarlane; анти-Е-кадгерин, анти-β-катенін, анти-p130CAS та анти-FAK антитіла були з лабораторій BD Transduction; антитубулінові антитіла були від Sigma. Інгібітори c-Src кінази були від лабораторій LC.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою двостороннього гомосцедастичного повторного вимірювання ANOVA. Значимість аналізували за допомогою парного t-тесту.

Результати

Придушення росту пухлини MMTV-PyMT шляхом обмеження вуглеводів

Пригнічення пухлини MMTV-PyMT за допомогою кетогенної дієти було підтверджено у трансгенних FVB-мишей MMTV-PyMT, яких годували протягом 4-12 тижнів стандартною дієтою з високим вмістом жиру або кетогенною дієтою, що складається з енергетичних співвідношень 3,2, 0,4 та 0,004, відповідно. Маса пухлини зменшилася на 65% при збільшенні енергії жиру за рахунок харчових вуглеводів (рис. 1А) із збільшенням латентності пухлини (не показано). Придушення пухлинної маси кетогенною дієтою супроводжувалось зменшенням фарбування BrdUrd (рис. 1В). Ступінь зменшення маси пухлини за допомогою кетогенної дієти була по суті подібною до тієї, яка застосовувалась MEDICA, дозована стандартною дієтою, багатою вуглеводами (рис. 1А).

Обговорення

Сімдесят відсотків раку молочної залози людини експресують активний c-Src, тоді як 50% - конститутивний STAT3 (12, 13). Крім того, повідомляється, що c-Src є загальним онкогенним рушієм змінних шляхів стійкості до трастузумабу, маючи на увазі, що придушення його активності може подолати резистентність (40). Подібним чином STAT3 відіграє важливу роль у стовбурових клітинах раку молочної залози, корелюючи з резистентністю до тамоксифену (41). Отже, стратегії лікування для придушення взаємодії c-Src/STAT3 є актуальними при лікуванні раку молочної залози людини (14).

c-Src відіграє обов'язкову роль у індукуванні раку молочної залози у трансгенних мишей MMTV-PyMT, у яких мембранне фосфорилювання PyMT за допомогою c-Src призводить до проліферації та виживання клітин (42). Отже, комплекс c-Src/PyMT може бути візуалізований як онкогенний RTK людини, причому c-Src виступає в якості його обов’язкової тирозинкінази. Одночасно, виживання клітин PyMT сприяє конститутивний STAT3 (5). Подібно до моделі MMTV-PyMT, тут показано, що виживання клітин раку молочної залози HCC1954 визначається як c-Src, так і STAT3. Варто зазначити, що онкогенні драйвери c-Src та STAT3 показані тут незалежно в просуванні MMTV-PyMT, а також виживання клітин HCC1954, підкреслюючи необхідність скасування обох для придушення раку молочної залози.

Показано, що придушення виживання клітин MMTV-PyMT та HCC1954 за допомогою MEDICA частково пояснюється придушенням шляху трансдукції STAT3, згідно з нашими попередніми звітами в інших типах клітин (26). Придушення STAT3 у клітинах MMTV-PyMT та HCC1954 за допомогою MEDICA відображається зниженням фосфо-STAT3 (Tyr705) та транскрипційної активності STAT3. Придушення виживання клітин за допомогою MEDICA додатково зумовлене утворенням ROS, викликаним MEDICA, що призводить до неактивного c-Src, який не може активувати свої субстрати нижче за течією (35, 38). Таким чином, тут показано лікування MEDICA для скасування асоціації c-Src з його риштуванням PyMT, а також для придушення фосфорилювання таких субстратів c-Src, як FAK (Ser925) та p130CAS (Tyr410) у клітинах HCC1954. Це, незважаючи на посилення автофосфорилювання c-Src (Tyr416), що передбачає режим інгібування активності трансформації c-Src, який відрізняється від того, що діє у класичних інгібіторів кінази c-Src (наприклад, дасатініб, саракатініб, босутиніб; посилання 43).

Повідомляється, що окислення c-Src призводить до його гетеродимеризації та інактивації (35), тоді як інші повідомляють про збільшення фосфорилювання c-Src Tyr416, що призводить до посилення його активності в кіназі, пухлини та метастазування (36, 37, 44). Підвищення рівня автофосфорилювання c-Src (Tyr416) та посилення активності кінази приписується окисленню c-Src, яке призводить до ковалентного зв’язку S-S між його SH2 Cys245 та Cys487 його домену кінази (37). На відміну від цього, повідомляється, що окислення Cys277 у гліциновій петлі c-Src GQGCFG призводить до олігомеризації c-Src та втрати активності c-Src (35), що, мабуть, зумовлене зниженням спорідненості c-Src до його субстратів, розташованих нижче за течією. Варто зазначити, що тут показано, що окислення c-Src індукованою MEDICA АФК призводить до скасування c-Src кінази та трансформаційної активності, одночасно збільшуючи її фосфорилювання Tyr416, маючи на увазі, що два режими окиснення модулюючої активності c-Src не є взаємними ексклюзивний. Дійсно, супутнє окислення c-Src двома окисними способами може призвести до того, що неактивні олігомери c-Src мають «відкриту» конформацію із збільшенням автофосфорилювання c-Src (Tyr416) (рис. 6D та G).

Придушення пухлини MMTV-PyMT за допомогою MEDICA призвело до придушення маси пухлини, проліферації, мітотичного індексу та ангіогенезу, одночасно сприяючи апоптозу пухлини. Найголовніше, що придушення виживання пухлини супроводжувалось збільшенням маркерів диференціації молочних залоз, що видно з пухлин, що складаються з папілярних залозистих структур, з кістами, вистеленими плоским епітелієм, заповненим рідиною, що містить казеїн. Раніше повідомлялося про подібний профіль диференціації у трансгенних мишей MMTV-PyMT, які отримували інгібітор c-Src-кінази босутинібом (SKI606; посилання 45), а також у мишей c-Src – null (42), маючи на увазі, що інгібує активність c-Src інгібіторами кінази генетично або шляхом її окислення може сходитися до подібного фенотипу.

Далі показано, що придушення росту пухлини MMTV-PyMT за допомогою MEDICA супроводжується придушенням метастазування в легенях. Придушення метастазування в легенях можна приписувати придушенню первинної пухлини, що призводить до зниження ймовірності поширення пухлини, що доповнюється інгібуванням епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМТ) пухлинних клітин. Дійсно, було виявлено, що лікування MEDICA індукує збагачення пухлинних клітин мембранним Е-кадгерином та β-катеніном, що супроводжується зменшенням транскрипту MMP9. Оскільки і STAT3, і c-Src є потужними індукторами ЕМТ (46, 47), епітелізацію пухлинних клітин за допомогою MEDICA частково можна віднести до скасування ЕМТ. Придушення ЕМТ за допомогою MEDICA може бути частково пояснено придушенням транскрипції Ezh2. Оскільки Ezh2 бере участь у контролі проліферації, диференціації та апоптозу клітин (31, 32), його придушення за допомогою MEDICA може додатково пояснювати придушення росту пухлини, одночасно сприяючи диференціюванню пухлини.

Розкриття потенційного конфлікту інтересів

Якоб Бар-Тана має право власності (включаючи патенти) у SyndromeX. Інші автори не розкривали жодного потенційного конфлікту інтересів.

Внески авторів

Концепція та дизайн: У. Глушнайдер, Р. Герц, Дж. Бар-Тана

Розробка методології: У. Глушнайдер, Р. Герц, Е. Пікарський

Збір даних (надані тварини, придбані та керовані пацієнти, надані засоби тощо): У. Глушнайдер, Р. Герц, С. Охайон, Е. Смейр, М. Смець

Аналіз та інтерпретація даних (наприклад, статистичний аналіз, біостатистика, обчислювальний аналіз): У. Глушнайдер, Р. Герц, С. Охайон, Е. Пікарський, Дж. Бар-Тана

Написання, рецензування та/або перегляд рукопису: У. Глушнайдер, Р. Герц, Е. Пікарський, Дж. Бар-Тана

Адміністративна, технічна або матеріальна підтримка (тобто звітування або організація даних, побудова баз даних): У. Глушнайдер

Нагляд за дослідженням: У. Глушнайдер, Дж. Бар-Тана

Інше (огляд статті): У. Глушнайдер, Є. Пікарський

Подяка

Автори дякують доктору Ітаю Бен-Порату за те, що він познайомив нас із моделлю MMTV-PyMT, та Інбалу Шаміру за допомогу в імуногістохімії.