Диференціальна експресія білка знаменує перехід від інфекції Opisthorchis viverrini до холангіокарциноми

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Резюме

Вступ

(A) Модель хом'ячка CCA була використана для ідентифікації дисрегульованих білків у хом'яків з індукованою ОВС CCA та у хом'яків, інфікованих Ov ("запалений" стан). Щоб викликати експериментальний ОВС-індукований CCA (група «ОВ-індукований CCA»), хом'яків заражали метацеркаріями Ov і їх дієту доповнювали NDMA. Група «інфікованих Ov» була інфікована Ov, але не отримувала NDMA; (B) Печінку хом'яка резекували, а iTRAQ та тандемну мас-спектрометрію використовували для визначення рівня експресії білка. Потім антитіла до п'яти білків використовували для підтвердження результатів iTRAQ як у хом'ячка, так і в тканинах людини за допомогою імуноблотингу та імуногістохімії.

Експериментальні процедури

Експериментальне проектування та статистичне обґрунтування

Кількісні експерименти iTRAQ були проведені на цілкових білкових препаратах печінки з трьох груп хом'яків: "Нормальна", "ОВ-індукована CCA" та "Ов-інфікована" групи, використовуючи три біологічні повтори з кожної групи. Для верифікації в тканинах печінки хом'яка вестерн-блот-експерименти та імуногістохімічний аналіз проводили з використанням чотирьох біологічних копій з кожної з трьох експериментальних груп. Вся тканина CCA людини була отримана за інформованою згодою пацієнтів лікарні Срінагарінд, Університет Хон Каен, Таїланд. Для вестерн-блот-експериментів у тканині CCA людини використовували сім біологічних повторностей, і в кожній повторній сусідній непухлинній тканині використовували як контроль. Білки-кандидати були додатково перевірені за допомогою IHC-аналізу на тканині, що містить ТМА, від 68 пацієнтів з CCA, 48 чоловіків та 20 жінок. Метою цього дослідження було виявлення потенційних потенційних клієнтів для подальшого дослідження, і кількість зразків переважно керувалася 1) витратами реагенту; і 2) наявність зразків.

Паразит і тваринна тканина

Метацеркарії яєць отримані від природно заражених риб-ципріноїдів у провінції Хон Каен, Таїланд, за встановленими методами [8]. Коротше кажучи, рибу засвоювали 0,25% пепсин-HCl та метацеркаріями, виділеними з отриманої суспензії. Метацеркарії досліджували мікроскопічно, підраховували і використовували життєздатні кісти для зараження хом'яків (Mesocricetus auratus). Усі зразки тканин тварин були взяті у хом'яків, що використовувались в імуногістохімічному дослідженні ОВС-індукованої CCA, описаному в [8] та затвердженому Комітетом з етики тварин Університету Хон Каен, Таїланд (AEKKU 22/2557). Експериментальна конструкція показана на рис. 1А. Хом'яків утримували в лабораторії досліджень тварин на медичному факультеті Університету Хон Каена за протоколами, затвердженими Комітетом з етики тварин Університету Хон Каен.

Індукована яйцеклітиною CCA у сирійських золотих хом'яків

Дванадцять чоловічих сирійських хом'яків (Mesocricetus auratus) у віці від 4 до 6 тижнів були випадковим чином розділені на три групи по чотири тварини: 1.) група "Звичайна", яка отримувала звичайну мишачу дієту (CP-SWT, Таїланд); 2.) група «ОВ-індукована CCA», яка інфікувалась метацеркаріями 50 Ov шляхом перорального посіву та годувала контрольну дієту з доповненням NDMA протягом перших двох місяців випробування (вводили у воді, доступній у вільному режимі, 12,5 ppm); та 3.) група «інфікованих ОВ», які заразили 50 метацеркаріями Ов пероральним щепленням і годували контрольною дієтою.

Тканина пацієнта

Тканини печінки людини готували, як описано в [14]. Письмова інформована згода була отримана від 68 пацієнтів CCA, 48 чоловіків та 20 жінок, які пройшли резекцію печінки в лікарні Срінагарінд університету Хон Каен, Таїланд між 1999-2010 рр. (HE571283). Пацієнти мали середній вік у роки 57 ± 7,7 (38-74 років). Комітет з етики досліджень людини, Університет Хон Каена, затвердив протоколи дослідження для отримання зразків печінки з біобанку Дослідницького центру печінкової гриппи та холангіокарциноми (HE571294). Заморожену тканину печінки із семи парних випадків пухлини (сусідніх непухлинних та пухлинних) використовували для вестерн-блот, а тканини печінки, вбудовані у парафін, з тих самих випадків використовували для імуногістохімічного аналізу. Тканинні мікрочипи (ТМА) були сконструйовані кафедрою патології медичного факультету Університету Хон Каена, як описано раніше [15]. ТМА містили 68 випадків CCA людини. Для підтвердження присутності інтактної пухлинної тканини підготовлено та оглянуто двома незалежними патологами ділянку блоку ТМА, пофарбовану H&E. Діагностика хворих на CCA оцінювалась за клінічними даними, візуалізаційним аналізом, онкомаркерами та патологією.

Очищення білка від печінки хом'яка

Тканину печінки хом'ячка (100 мг) від кожного хом'ячка в кожній групі суспендували в 600 мкл буфера для лізису (7М сечовини, 2М тіосечовини, 4% (мас./Об.) CHAPS і 40 мМ трис-основи) та гомогенізували за допомогою гомогенізатора мікротрубок при 4 ° C протягом 5 хв. Зразок обробляли ультразвуком протягом 1 хв і інкубували на льоду протягом 30 хв. Солюбілізовані зразки центрифугували при 12000 × g протягом 20 хв при 4 ° C. Зразки білка осаджували 6 обсягами холодного ацетону при -20 ° С протягом ночі. Потім білки гранулювали, використовуючи центрифугування при 8000 × g при 4 ° C протягом 10 хв, і гранули ресуспендували в 0,5М бікарбонаті триетиламонію (TEAB), рН 8,5 (Sigma-Aldrich) і 0,1% SDS. Кількості білків визначали за допомогою аналізу білків Бредфорда (Bio-Rad), використовуючи рекомендації виробників.

Відновлення, алкілування та маркування iTRAQ

Загальний білок печінки з трьох біологічних повторностей аналізували в трьох експериментах iTRAQ. Білки печінки (100 мкг) від трьох хом'яків у кожній групі редукували, алкілювали та мітили за допомогою мультиплексного набору iTRAQ 8PLEX (AB Sciex, США). Коротко, зразки білка зменшували за допомогою 10 мМ дитиотрейтолу при 60 ° С протягом 1 год і алкилировали в 50 мМ йодоацетаміду або метилметантиосульфонаті (ММТС) при 37 ° С протягом 30 хв. Потім білки перетравлювали 2 мкг трипсину при 37 ° С протягом 16 годин. Реагенти для мічення iTRAQ готували шляхом додавання 50 мкл ізопропанолу до кожного флакона, а потім їх використовували для маркування зразків пептидів протягом 2 годин при кімнатній температурі. Мічені пептиди об'єднували у три суміші, що представляли три біологічні повторності, кожна з яких містила чотири зразки пептидів ("ОВ-індукований CCA", "Ов-інфікований" та два контрольні канали). Після маркування пептидні суміші очищали за допомогою іонообмінних колон HiTrap (GE Healthcare) та знесолювали за допомогою картриджа Sep-Pak Vac C18 (Waters, США). Потім очищені фракції ліофілізували перед OFFGEL ™ .

Фракціонування OGE

Фракціонатор 3100 OFFGEL та набір OFFGEL pH 3–10 (Agilent Technologies, Німеччина) з установкою на 24 лунки були підготовлені відповідно до протоколів виробника. Ліофілізовані пептидні суміші розбавляли до кінцевого об'єму 3,6 мл за допомогою розчину зразка пептиду OFFGEL. Гелеві смужки IPG (24 см) з лінійним діапазоном рН 3–10 (GE Healthcare, Німеччина) регідратації розчином для регідратації смужки IPG Strip відповідно до протоколу виробників і 150 мкл зразка завантажували в кожну лунку. Пептиди ізоелектрично фокусували з максимальним струмом 50 мкА до досягнення 50 кВ-год. З кожної лунки було вилучено 24 фракції, і лунки промивали 150 мкл води/метанолу/мурашиної кислоти (49/50/1) протягом 15 хв. Кожну фракцію ліофілізували, а потім ресуспендували в 15 мкл H2O з 5% (об/об) мурашиної кислоти перед аналізом LC-MS/MS.

Виділення та очищення екзосом з клітинної лінії KKU055

Оцінка наявності та чистоти екзосом

Електронну мікроскопію застосовували для виявлення фракцій, що містять екзосоми, та для підтвердження чистоти екзосом у препаратах екзосом. Аліквота по 2 мкл від кожної з зразків екзосом із фракцій градієнта щільності в розчині Tris-HCl (рН 7,5) безпосередньо адсорбувалась на сітчасто-розряджених мідних покриттях із покриттям вуглецю та вуглецю на предметних стеклах (AgarScientist, Великобританія) для отримання моношару екзосом для аналізу. Потім кожне предметне скло негативно фарбували свіжоприготованим 2% -ним уранілацетатом у водній суспензії. Сітки висушували на повітрі протягом 3 хв і знімали за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа JEM-100CX (JEOL, Японія), оснащеного термоелектричною вольфрамовою ниткою і працювали при напрузі прискорення 100 кВ. Цифрові зображення були зроблені з розміром пікселів 0,3 нм за допомогою камери Olympus Morada із часом витримки від 100 до 400 мС.

Очищення білка екзосоми та SDS-PAGE

Ізольовані екзосоми розчиняли в 1 мл 1xPBS і центрифугували при 100000xg протягом 60 хв при 40 ° С для гранулювання екзосом. Гранулу ресуспендували в 200 мкл крижаного екзосомного буфера для ресуспендування (загальна РНК екзосоми та набір для ізоляції білка, Invitrogen). Зразок інкубували протягом 5–10 хв при кімнатній температурі, щоб осадок розчинився. Після цього злегка піпетували зразок, щоб переконатись, що гранула повністю розчинилася. Осадження ацетону проводили додаванням об'єму ацетону 1: 5 та інкубацією протягом ночі при -20 ° C. Потім зразки центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв при 40 ° С. Надосадову рідину відкидали і гранулу знову промивали ацетоном і центрифугували при 10000 об/хв протягом 15 хв при 40 ° C. Гранулу розчиняли в 10 мкл буфера леемлі та інкубували при 96 ° С протягом 3-5 хвилин. Цей розчин завантажували в гель проти послідовності (Precision Plus Protein TM Dual Color Standards) і піддавали SDS-PAGE та в гелю розщепленню.

Тандемна мас-спектрометрія

Спектральні пошуки та біоінформаційний аналіз

(A) Репрезентативний спектр з тандемної мас-спектрометрії білків печінки хом'ячка з іонами-репортерами, що використовуються для кількісного визначення (вставка); (B) Ефективність маркування оцінювали за допомогою пошуку, що визначає мітки iTRAQ як змінні модифікації; (C.) У кожній реплікації iTRAQ дві аликвоти одного контрольного зразка були позначені різними іонами-репортерами та використані як внутрішня перевірка коефіцієнтів експресії.

Білки, нерегульовані під час зараження ОВ та індукованого ОВС CCA

Відібрані білки, визначені як нерегульовані в печінці хом'яків з експериментально індукованою CCA та хом'яків, інфікованих Ov. Використовувані скорочення: Невикористаний - оцінка ProteinPilot для ідентифікації білка; SC - кількість унікальних пептидів, що використовуються для ідентифікації білка; Вираз CCA - кратна зміна білка в порівнянні з нормальною контрольною пробою; Вираз Заражені яйцеклітиною - відносна зміна складки порівняно з нормальною контрольною пробою.

Перевірка даних iTRAQ у тканині хом'ячка

Для забезпечення незалежного виміру експресії білка в тканині хом'ячка було відібрано п’ять білків для імуногістохімії (IHC) та імуноблотингових експериментів на основі 1.) сили їх порушення регуляції та 2.) функціональної значимості білка. У групі `` ОВ-індукованої CCA '' імуноблотинг з п'яти білків (S100A6, люмікан, пластин-2, 14-3-3 зета/дельта та віментин) демонстрував той самий профіль експресії, який спостерігався в експериментах iTRAQ (рис. 4А та В). . У групі, інфікованій Ov, чотири білки (проларгін, пластин-2, 14-3-3 дзета/дельта та віментин) також виявляли той самий профіль експресії в експериментах з іммуноблотингом, що спостерігався в експериментах iTRAQ (дані не показані) . В експериментах IHC з використанням градуйованої пухлинної тканини з групи, що індукується ОВС, експресія S100A6, люмікану, пластину-2 та 14-3-3 дзета/дельта спостерігалася в цитоплазмі пухлини жовчних проток, тоді як виментин знаходили головним чином в цитоплазмі фібробластів при перидуктальному фіброзі та стромі пухлини (рис. 4С). Ще раз, експресія білка відображала те, що спостерігалося в експериментах iTRAQ (рис. 4C і D).

Зміни експресії п'яти білків (S100A6, люмікан, пластин-2, 14-3-3 дзета/дельта та віментин) оцінювали за допомогою вестерн-блот та імуногісто-хімічного фарбування тканини людини. (A) Вестерн-блот-аналіз у семи парних випадках пухлини (N, сусідні непухлинні та T, пухлинні тканини); (B) відносні інтенсивності смуг нормували за середньою нормою і наносили на графіки розсіювання. Зірочка (*) позначає суттєву різницю (p Білки, гомологічні білкам хом'ячка, нерегульованим в CCA, які були ідентифіковані в екзосомах, секретованих клітинною лінією CCA людини KKU055. Двадцять сім білків екзосом людини з 282 загальних ідентифікацій виявилися гомологічними (біт BLAST) оцінка> 50) до білків, нерегульованих у хом'ячої моделі CCA. Сюди входили деякі з найбільш надмірно експресованих білків у печінці хом'яків хом'яків з CCA. Праворуч, електронна мікрофотографія пропускання препарату екзосоми, що використовується в експериментах з протеоміки.

Двадцять сім білків екзосом людини, із загальної кількості ідентифікацій 282, виявились гомологічними (бітовий бал BLAST> 50) білкам, нерегульованим на хом'ячій моделі CCA. Сюди входили деякі з найбільш надмірно експресованих білків у печінці хом'яків хом'яків з CCA. Справа - передавальна електронна мікрофотографія препарату екзосоми, що використовується в експериментах з протеоміки.

Обговорення

30% випадків CCA, пов’язаних з Ov. У поточному дослідженні ми використовували передові протеомічні методи (ізобарне маркування та тандемну мас-спектрометрію) на тваринах на різних стадіях переходу від Ov-інфекції до CCA, індукованої Ov, щоб виявити велику кількість потенційних маркерів для CC-асоційованої CCA, що також може відрізнити асоційований з ОВС CCA від запалення, яке супроводжує хронічну Ov-інфекцію у людей, що мешкають в ендемічних районах Ov, і яке може бути додатково оцінено щодо їх застосування як діагностичних маркерів CCA.

Загалом, холангіокарциногенез пов’язаний із широким спектром клітинних змін, які відображаються у профілі експресії білка пухлинної тканини. У поточному дослідженні ми використали надійну модель хом'ячка ОВК-індукованої CCA для профілювання цих профілів експресії білка за допомогою кількісних методів білка iTRAQ та тандемної мас-спектрометрії для виявлення потенційних маркерів при переході від Ov-інфекції до Ov-асоційованої CCA. Використовуючи ізобаричне маркування, ми виявили понад 200 нерегульованих білків, які тепер можуть бути інформацією щодо майбутніх зусиль з розробки біомаркера для діагностики ОВС-асоційованої CCA. Надмірна експресія п’яти білків була підтверджена в тканині хом'ячка, і, що ще важливіше, три з цих п'яти білків потім підтвердили надмірну експресію в пухлинній тканині, пов'язаній з Ov. Останнє спостереження припускає, що надмірно експресовані білки, виявлені в хом'ячій моделі ОВК-індукованої CCA, також можуть бути надмірно експресованими в CCA, пов'язаної з Ov. У сукупності ці дані забезпечують основу для подальших зусиль з розробки біомаркерів та потенційних терапевтичних засобів для діагностики та лікування ОВС-асоційованої CCA, а також інших ракових захворювань, пов’язаних з інфекцією.