Дієтичний жир змінює легеневі метастазування раку молочної залози шляхом ракових автономних та неавтономних змін у експресії гена

Мікеле Ла Меррілл

Кафедра превентивної медицини, Медична школа Маунт-Сінай, коробка 1057, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10029, США

Навчальна програма з токсикології, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Хілл, NC 27599, США

Департамент генетики, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Хілл, NC 27599, США

Райан Р. Гордон

Департамент харчування, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Гілл, NC 27599, США

Кент В. Хантер

Лабораторія біології та генетики раку, NIH/NCI, Бетесда, MD 20892, США

Девід В. Тредгілл

Навчальна програма з токсикології, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Хілл, NC 27599, США

Департамент генетики, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Хілл, NC 27599, США

Центр екологічного здоров’я та сприйнятливості, Раковий центр Лінебергера та Центр наук про геном Кароліни, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна, 27599, США

Даніель Помп

Навчальна програма з токсикології, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Хілл, NC 27599, США

Департамент генетики, Університет Північної Кароліни в Чапел-Гілл, Чапел-Гілл, NC 27599, США

Департамент харчування, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Гілл, NC 27599, США

Центр екологічного здоров'я та сприйнятливості, Центр раку Лінебергера та Центр наук про геном Кароліни, Університет Північної Кароліни в Чапел-Хілл, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна 27599, США

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Прогноз раку молочної залози значною мірою визначається рівнем метастазування і на нього впливають негенетичні фактори, такі як дієта, яка також є основним фактором ожиріння. Велике проспективне дослідження на американських жінках продемонструвало, що жінки з ожирінням у найвищому квінтілі індексу маси тіла (ІМТ) мали вдвічі більшу смертність від раку молочної залози, ніж у жінок із найнижчим квінтилем ІМТ [1], можливо, через більший ризик метастазу [2]. Зв'язок між ожирінням та ризиком раку молочної залози має певні генетичні підґрунтя; жінки, які мають сімейну історію раку молочної залози, набагато частіше хворіють на рак молочної залози, коли страждають ожирінням, а не худими [3]. Ожиріння може бути пов'язане з вірулентним раком молочної залози як за допомогою проліферативних, так і запальних механізмів [4, 5]. Наприклад, адипоцити секретують фактор некрозу пухлини адипоцитокінів (TNFα) і фактор росту судинного ендотелію (VEGF), які пов’язані з раком молочної залози [4].

Значна частина сучасних досліджень метастазування раку молочної залози демонструє важливу роль ангіогенезу та інвазії. Члени сім'ї VEGF пов'язані з поганим прогнозом, здебільшого через їх ангіогенну ефективність [6]. Крім того, дослідження метастатичної інвазії раку молочної залози часто включають представників сімейства матриксних металопептидаз (ММР), які реконструюють первинну пухлину шляхом інтравазації та метастазування в легені насіння шляхом посередницької екстравазації [7, 8]. Кілька гормональних шляхів, що модифікують ожиріння, можуть взаємодіяти в процесах ангіогенезу та інвазії; наприклад, естрадіол регулює MMP2 та тканинний інгібітор металопротеїнази 1 (TIMP1) [9]. Хоча були зроблені спроби охарактеризувати механістичні події, що зумовлюють метастазування та асоційований з ожирінням рак молочної залози, мало хто характеризує механістичні взаємозв'язки між ожирінням, раком молочної залози та його метастазами.

Для того, щоб вивчити механізми, що лежать в основі взаємодії ожиріння з раком молочної залози та його метастазуванням, ми розробили модель метастазування раку молочної залози у ожирілих мишей шляхом перетину M16i, полігенної лінії ожиріння, з FVB/NJ-TgN (MMTV-PyMT) 634Mul (PyMT ) [10, 11]. PyMT розвиває агресивні пухлини молочної залози з подальшим легеневим метастазуванням і має первинну експресію гена пухлини, подібну до експресії генів просвітних пухлин молочної залози у жінок [12, 13]. Миші з отриманої популяції мишей F2, ко-сегрегуючі локуси кількісних ознак ожиріння (QTL) та трансгену MMTV-PyMT при харчуванні з високим вмістом жиру (HFD), порівняно з тими, хто харчувався відповідною контрольною дієтою (MCD), мали на 8,6% більше маси тіла, На 21,8% збільшився загальний жир у тілі, зменшилась затримка раку молочної залози (3 дні), пухлини молочної залози збільшилися в 1,5 рази та метастази в легенях збільшились на 46–68% (залежно від методу вимірювання) [10, 11]. Ці істотні дієтичні ефекти були помітні, незважаючи на те, що миші F2 на будь-якій дієті були важчими, ніж PyMT, на цих самих дієтах [14].

Загальногеномний аналіз однонуклеотидного поліморфізму (SNP) виявив сильну генетичну роль у модифікації сприйнятливості легеневих метастазів цієї моделі, а дієта суттєво взаємодіяла з новими легеневими метастазами QTL у всіх виявлених восьми локусах модифікаторів [10]. Оскільки ми раніше показали, що дієта з високим вмістом жиру пов'язана зі збільшенням метастазів раку молочної залози і, схоже, змінює генетичну сприйнятливість до легеневих метастазів, ми досліджували, чи може збільшення метастазів бути зумовленим змінами в транскриптомі первинного раку. Процеси розповсюдження, запалення, ангіогенезу та інвазії були суттєво очевидними. Наприклад, амілоїд A (Saa2) у сироватці крові, пов’язаний з міграцією легеневих метастазів, регулювався HFD у пухлинах молочної залози. Крім того, ген бутирофіліну молочного компоненту (Btn1a1) був ідентифікований у списку біомаркерів вірулентності метастазів, знаходиться під метастатичним QTL, що взаємодіє з HFD, і зіставлений у eQTL на 7 см від його фізичного розташування в хромосомі 13. Ці результати дозволяють припустити що Btn1a1 слід додатково вивчити як біомаркер ризику метастазування раку молочної залози серед жінок, які споживають дієту з високим вмістом жиру.

Матеріали і методи

Виробництво худоби та зразків

Виділення РНК та аналіз мікрочипів

РНК як з пахвової пухлини молочної залози, так і з печінки окремих мишей виділяли реактивом TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) та ампліфікували за допомогою набору для ампліфікації РНК Illumina® TotalPrep, обидва згідно з інструкціями виробника (Ambion, Austin, TX). Розчин, що містить 1,5 мкг високоочищеної біотінільованої кРНК, наносили на поверхню Illumina Mouse 6 Sentrix (версія 1, Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія) і гібридизували при 55 ° C протягом 17,5 год. Після періоду гібридизації масиви поміщали в високотемпературний змивний буфер (Illumina) на 10 хв, E1BC буфер (Illumina) на 5 хв, 100% етанол на 10 хв, E1BC буфер (Illumina) на 2 хв, блок E1 буфер на 10 хв і качали 2 мл стрептавідину-Cy3 (1 мг/мл у буфері блоку E1, Ілюміна) протягом 10 хв. Потім масиви промивали в буфері E1BC, сушили і оцінювали на сканері бісеру Illumina.

Обробка даних мікрочипів

Сирі дані, що містять

46000 наборів зондів були перетворені в журнал, а потім нормалізовані, використовуючи комбінацію методів Лесса та Квантиля, доступних у програмі оцінки Люмі на основі R для даних виразу Illumina [15]. Лесс з наступною квантильною нормалізацією ідентичної об'єднаної РНК пухлини молочної залози пробігали по 11 чіпах, отримуючи значення R 2 0,95. Для того, щоб усунути транскрипти, які не були суттєво виражені вище фонового сигналу, дані фільтрувались з оцінкою виявлення ілюмінації 0,95 і вище.