Дієтична індукція та модуляція ферроптозу у Caenorhabditis elegans

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

РЕЗЮМЕ

Ферроптоз - це залізозалежна форма регульованої загибелі клітин, пов’язана з окисленими поліненасиченими фосфоліпідами. Розуміння ролі цього процесу in vivo сповільнюється відсутністю легкодоступних модельних систем. Вплив нематоди Caenorhabditis elegans на поліненасичену жирну кислоту дигомогамма-ліноленова кислота (DGLA; 20: 3n-6) спричинює загибель та стерильність зародкових клітин, що значною мірою не залежить від канонічного шляху апоптозу. Тут ми демонструємо, що DGLA-індукована загибель зародкових клітин модулюється за допомогою малих молекул інгібіторів ферроптозу, генетичних маніпуляцій з феритином, NADPH-оксидазою та глутатіонпероксидазами та шляхом дієтичного доповнення олеїновою кислотою. Таким чином, індукована DGLA загибель зародкових клітин у C. elegans є дуже аналогічною ферроптозу в клітинах ссавців. DGLA також може індукувати ферроптоз у клітинах людини, додатково виділяючи цю омега-6 PUFA як метаболічний стимулювач ферроптозу. Разом ці результати дозволяють встановити C. elegans як потужну тваринну модель для вивчення індукції та модуляції ферроптозу харчовими жирами.

Основні моменти

- Індукована дієтичною дігомогама-лінолевою кислотою (DGLA) загибель зародкових клітин у C. elegans полегшується за рахунок малих молекул антиоксидантів та хелаторів заліза

- Дієтична та ендогенна олеїнова кислота захищає від ферроптозу, викликаного DGLA

- Дефіцит ефіру-ліпідів підвищує чутливість до ферроптозу, викликаного DGLA

- DGLA спеціально індукує ферроптоз у ракових клітинах людини

ВСТУП

Поліненасичені жирні кислоти з довгими ланцюгами (ПНЖК) мають важливе значення в харчуванні людини, хоча досі існують суперечки щодо оптимальної кількості різних видів харчових жирів (Mukhopadhyay, 2012). PUFA класифікуються як омега-6 (n-6) або омега-3 (n-3), залежно від положення кінцевого подвійного зв’язку в молекулі. Омега-6 жирні кислоти є попередниками потужних сигнальних молекул, таких як простагландини та лейкотрієни, що сприяють запальній реакції. Ці відповіді важливі для боротьби з патогенами та для нормального розмноження, але надлишок омега-6 жирних кислот пов'язаний із захворюваннями, такими як серцево-судинні захворювання та рак (Harris et al., 2009).

Ферроптоз, залізозалежна форма регульованої неапоптотичної загибелі клітин, визначається трьома збереженими ознаками - наявністю окислених поліненасичених жирних кислот (ПНЖК), наявністю окисно-відновного заліза та дефектним або інгібованим відновленням перекису ліпідів (Діксон) та Стоквелл, 2019). Ферроптоз був продемонстрований у декількох системах ссавців, включаючи різні клітинні лінії раку (Dixon et al., 2012; Dixon et al., 2014), індуцибельні миші-мутанти Gpx4 -/(Friedmann Angeli et al., 2014; Ingold et al., 2018), зрізи гіпокампа щурів та культури олігодендроцитів (Dixon et al., 2012; Skouta et al., 2014). У клітинах ссавців ферроптоз може бути придушений за допомогою малих молекул заліза хелаторів заліза та антиоксидантів, що захоплюють радикали (Stockwell et al., 2017). На сьогодні фізіологічна значимість та регуляція ферроптозу є предметом великого інтересу, але вплив дієти на ферроптоз не вивчався. Прогресу в цьому та інших супутніх питаннях заважає відсутність доступних і простих в управлінні моделей тварин ферроптотичного процесу.

Нематода Caenorhabditis elegans (C. elegans) є потужною моделлю для дослідження значення дієтичних жирних кислот у розвитку та підтримці зародкової лінії. Цей вид синтезує широкий спектр жирних кислот de novo (Hutzell and Krusberg, 1982; Watts and Browse, 2002), а також росте і розмножується в широкому діапазоні температур. Розмноження є енергетично інтенсивним процесом, коли в пік відкладання яєць дорослий гермафродит щодня перетворює еквівалент всієї маси свого тіла на яйця (Hirsh et al., 1976). Дієтичні жири є важливим джерелом ліпідів для вироблення яєць C. elegans, а жирні кислоти в організмі перетворюються кожні 24 години (Dancy et al., 2015).

Раніше ми виявили, що C. elegans, культивований у присутності поліненасиченої жирної кислоти дигомогамма-лінолевої кислоти (DGLA, 20: 3n-6), став стерильним (Watts and Browse, 2006). Гермафродити дикого типу, вирощені на DGLA, сильно дефіцитні у виробництві зародкових клітин, а вплив нижчих рівнів DGLA, що не викликало 100% стерильності серед населення, тим не менше призвело до зменшення кількості статевих клітин, сперми та потомства (Watts and Browse, 2006). Генетичні шляхи, що регулюють реакції на окислювальний стрес, ліпідний гомеостаз та тривалість життя, модулювали чутливість до дієтичного DGLA (Watts and Browse, 2006; Webster et al., 2013), як і маніпуляції ферментами окислення PUFA (Deline et al., 2015).

У цьому дослідженні ми перевірили гіпотезу про те, що дієтична DGLA-індукована загибель зародкових клітин відбувається через ферроптоз. Використовуючи хімічну біологію, генетичний та ліпідомічний підходи, ми повідомляємо, що залізо, активні форми кисню (АФК) та ліпідний обмін модулюють вплив дієтичного ДГЛА на репродуктивну систему глистів. Крім того, добавок DGLA достатньо для індукування ферроптозу в ракових клітинах людини, демонструючи можливість опосередкованого дієтою ферроптозу у всіх видів.

РЕЗУЛЬТАТИ

Дієтична DGLA викликає загибель ферроптотичних зародкових клітин

Дієтичний DGLA є потужним індуктором загибелі зародкових клітин у C. elegans, і генетичні дані свідчать, що це може бути частково окислювальним процесом (Deline et al., 2015; Watts and Browse, 2006; Webster et al., 2013). Щоб перевірити, чи включає цей процес ферроптоз, ми спільно обробляли тварин дикого типу дієтичним DGLA та ферроптозом-специфічним ліпофільним радикалом, що захоплює антиоксидант ферростатин-1 (Fer-1) (Dixon et al., 2012; Zilka et al., 2017 ). Вражаюче, що у тварин, які отримували спільне лікування з DGLA та Fer-1, загибель і стерильність зародкових клітин були зменшені порівняно з глистами, які отримували лише DGLA (рис. 1А). Сам фер-1 не впливав на фертильність. Мало того, що в групі лікування DGLA + Fer-1 було більше запліднених черв’яків порівняно з однією лише DGLA, але і кількість запліднених черв’яків з нормальним розвитком гонад, як оцінювали за допомогою фарбування DAPI, було збільшено порівняно з контрольною групою (Рисунки 1B, C ).

(A) Відсоток (%) стерильності червів дикого типу, що годуються зазначеними комбінаціями олеїнової кислоти (ОА) та DGLA. Графіки показують середній відсоток стерильності у п’яти популяціях із 50 черв’яків, що зазнали впливу різних концентрацій DGLA та OA. Зірочки демонструють значення P N). Це дозволило нам відстежувати загибель клітин за допомогою масштабованого підходу аналізу кінетики клітинної смерті (STACK) (Forcina et al., 2017). Подібно до позитивного контролю, малий молекулярний індуктор ферроптозу, ерастин2, екзогенний DGLA (500 мкМ) здатний викликати загибель клітин, чутливих до ферростатину-1, протягом 24 годин (рис. 3А, В). При тій же концентрації екзогенний АА спричиняв загибель клітин, але це не було ефективно придушено з часом спільним лікуванням Fer-1, що вказує на те, що при цій дозі екзогенний АА може сприяти іншим способам клітинної загибелі (рис. 3А). При менших дозах (250 мкМ і нижче) і DGLA, і АА виявляли незначну летальність у клітинах HT-1080 N (рис. 3А). Таким чином, екзогенних омега-6 ПНЖК достатньо для того, щоб викликати ферроптоз як окремі агенти в ракових клітинах людини специфічно для структури.

(A) Клітинна загибель (летальна частка) з часом у клітинах HT-1080 N, оброблених ± ерастином2, DGLA або арахідоновою кислотою (AA) та ± Fer-1 (1 мкМ). (B) Репрезентативні зображення, що показують поле HT-1080 N клітин, оброблених ± DGLA (500 мкМ) ± ферростатин-1 (Fer-1, 1 мкМ). Живі клітини експресують локалізований ядерний mKate2; мертві клітини займають SYTOX Green. Зображення отримували через 72 год після обробки. (C) Конфокальні зображення C11 BODIPY 581/591 (тут "C11") у комірках HT-1080. Після обробки протягом 8 год клітини мітили C11 (5 мкМ) та Hoechst (1 мкг/мл) перед візуалізацією. C11 Ox: окислений C11; C11 Non-Ox: Неокислений C11. Шкала шкали = 20 мкм. (D) Теплова карта, що показує відносні складчасті зміни складу жирних кислот різних класів ліпідів через 6 годин росту за допомогою DGLA (500 мкМ або 250 мкМ) порівняно з контролем етанолу. ПК: фосфатидилхолін, ПЕ: фосфатидилетаноламін, нейтральний: нейтральні ліпіди. Сірі рамки вказують на ситуації з концентрацією жирних кислот менше 0,4%. Дані представляють середні значення трьох незалежних експериментів.

ОБГОВОРЕННЯ

Тут ми повідомляємо, що ферроптоз може бути індукований у статевих клітинах C. elegans, що піддаються дії поліненасичених жирних кислот DGLA. Цьому смертельному фенотипу сприяє активність NOX та залізо, а йому протистоїть глистові ортологи та антиоксиданти GPX4. У цьому відношенні процес, який спостерігається у статевих клітинах C. elegans, є дуже аналогічним ферроптозу в клітинах ссавців (таблиця 1 та посилання на нього). Специфічність DGLA-індукованого ферроптозу для статевих клітин молодих тварин представляє великий інтерес. Харчові ліпіди можуть переважно концентруватися в цих клітинах під час швидкого та метаболічно складного процесу утворення клітин, що відбувається в синцитіальній гонаді. Інша можливість полягає в тому, що сама зародкова лінія може мати дефіцит антиоксидантного захисту (або збагачена ферментами прооксидантів), що робить ці клітини гіперчутливими до накопичення пероксидів ліпідів порівняно з соматичними клітинами. Цікаво, що ферроптоз може також виникати в клітинах кишечника у віці C. elegans (Jenkins, BioRxiv 2019). Тут сам процес старіння може призвести до втрати контролю над гомеостазом заліза чи іншими процесами, які зазвичай стримують ферроптоз у соматичних тканинах. Разом ці результати дозволяють встановити C. elegans як потужну та генетично відслідковувану модель тваринного ферроптозу.

ВНОСИ АВТОРА

Концептуалізація: J.L.W. та S.J.D. Методологія та дослідження: M.A.P, L.M .; Написання, редагування та рецензування: M.A.P., L.M., S.J.D., J.L.W .; Придбання та нагляд за фінансуванням: J.L.W. та S.J.D.

ДЕКЛАРАЦІЯ ІНТЕРЕСІВ

S.J.D. є членом науково-консультативної ради Ferro Therapeutics.

Додаткові експериментальні процедури

Контакт для спільного використання реагентів та ресурсів

Подальшу інформацію та запити на ресурси та реагенти слід направляти та виконувати провідним контактом Дженніфер Ваттс (jwattswsu.edu).

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МОДЕЛЬ І ДЕТАЛІ ТЕМИ

C. elegans штами та підтримка

Запаси нематод підтримували на пластинах із середовищем росту нематод (NGM), засіяних бактеріями (E. coli OP50) при 20 ° C. Наступні штами/алелі, використані в цьому дослідженні, були отримані з генетичного центру Caenorhabditis (CGC): N2 Bristol (дикого типу), CB767 bli-3 (e767), MT1522 ced-3 (n717). Штам GA912 ftn-1 (ok3625) був подарунком доктора Девіда Джемса (Університетський коледж Лондона, Лондон, Великобританія). Штам OB266 bli-3 (im10) був подарунком доктора Даніелі Гарсін (Технічний науковий центр охорони здоров'я Техасу, Х'юстон, Техас, США).

Клітинні лінії та хімікати

Клітини HT-1080 (Cat # ATCC CCL-121) були придбані у ATCC, розширені на один прохід, аликвотно розподілені та заморожені при -140 ° C до використання. Клітини HT-1080 N (стать: чоловіки) були описані раніше (Forcina et al., 2017). Ерастин2 (сполука 35MEW28 у (Dixon et al., 2014)) був синтезований компанією Acme Bioscience (Пало Альто, Каліфорнія). Диметилсульфоксид (DMSO, Cat # 276855) та ферростатин-1 (Cat # SML0583) були від Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі). Етанол (Cat # AX0441-3) був від компанії EMD Millipore (Billerica, MA). Дігомо-γ-ліноленова кислота (DGLA, Cat # 90230) була від Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). SYTOX Green (Cat # S7020) був від молекулярних зондів (Eugene, OR). Всі сполуки зберігали при -20 ° С.

ДЕТАЛІ МЕТОДІВ

Добавки жирних кислот для аналізу стерильності C. elegans

Раніше описані середовища, що містять жирні кислоти (Deline et al., 2013). До середовищ NGM 0,1% тергітолу NP40 (Sigma Chemicals Cat # NP40S) та натрієва сіль дигомо-гамма-ліноленової кислоти (DGLA, 20: 3n-6) (NuChek Prep, Inc. Cat # S-1143) або олеїнова кислота (OA, 18: 1n-9) (NuChek Prep, Inc. Cat # S-1120) додавали при різних концентраціях в діапазоні від 0,1 мМ до 0,3 мМ DGLA. Джерелом їжі E.coli OP50 висівали пластинки за 3 дні до висадки сінхронізованих личинок C. elegans L1. Дорослим глистам оцінювали стерильність на 72-96 годині, де стерильність визначали шляхом підрахунку глистів з відсутністю ембріонів, як показано порожньою маткою за допомогою світлової мікроскопії. Тести на стерильність були оцінені та усереднені за п’ятьма окремими пластинами кожного генотипу, кожна з яких складається з 50 нематод. Стерильність порівнювали між контрольними та експериментальними популяціями, використовуючи двосторонній t-тест студента. Екзогенне поглинання жирних кислот нематодами було підтверджено шляхом прямої переетерифікації популяцій нематод з використанням 2,5% H2SO4 протягом однієї години при 70 ° C для утворення метилового ефіру жирних кислот (FAMEs). FAMES екстрагували гексаном для газової хроматографії/аналізу мас-спектрометрії (GC/MS) (Watts and Browse, 2002).

Добавки ферростатину-1 та DGLA

Пластини DGLA виготовляли заздалегідь, додаючи різні концентрації до розплавленого агару NGM перед покриттям. OP50 висівали і давали йому висохнути протягом двох днів перед покриттям ліків та глистів. Ферростатин-1 (Fer-1) (Sigma-Aldrich Cat # SML0583) розчиняли в диметилсульфоксиді (DMSO, Cat # 276855) і розводили до відповідних концентрацій у 10% ДМСО перед тим, як незабаром нанести на джерело їжі OP50. Розчин Фер-1 або контрольний ДМСО дозволяли всмоктуватися в пластини протягом 20-30 хвилин перед додаванням нематод на стадії L1.

Добавки тролоксу та 2,2’-біпіридину (АТ) DGLA

2,2-біпіридій (BP) (Sigma-Aldrich Cat # D216305) (75 мкм) або Trolox (Cayman Chemicals Cat # 10011659) додавали безпосередньо до агару NGM. Або ліки, або еквівалентну об'ємну кількість транспортного засобу, DMSO, додавали до розплаву разом з різними концентраціями DGLA в агар NGM перед заливанням у пластини.

РНК-опосередкована інтерференція (RNAi) генів глутатіонпероксидази на DGLA

RNAi шляхом подачі на пластини з добавкою DGLA проводили, як описано раніше (Deline et al., 2013). E. coli HT115, що експресує контроль порожнього вектора L4440 або клони gpx RNAi, були отримані з бібліотеки Арінгера (Source Biosource) та перевірені шляхом секвенування (Kamath et al., 2003).

DAPI фарбування для візуалізації статевих клітин

Для візуалізації статевих клітин після годування (або DGLA/DMSO, DGLA/250мкМ Fer-1, або DGLA/1мМ Trolox) хробаки промивали 1 мл буфера M9 і розподіляли на годинникове скло. Більшість буфера М9 просочували сухим способом, а потім хробаків фіксували і фарбували етанолом, що містить 0,2 мкг/мл 2 ', 6-діамідино-2-феніліндол (DAPI) (Fisher Scientific, Cat # D1306), і дозволяли фіксувати пляма протягом 10 хвилин. Черв'яків поміщали на покривний склянку з крапелькою води і приклеювали до 2% -ної агарової подушки, що містила предметне скло. Зображення отримували за допомогою мікроскопа Olympus BX53 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan) з об'єктивом 10X.

Експерименти із загибелі клітин ссавців

За день до експерименту 5000 клітин HT-1080 N/лунку висівали в 96-лунковий планшет (Cat # 3904, Corning). На наступний день середовище культури клітин замінювали ДМСО (носій) або Фер-1 (1 мкМ) та етанолом (носій) або ДГЛА (2-кратна серія відповідей на 10 точкових доз, починаючи з 500 мкМ). SYTOX Green (20 нМ) був включений у всі лунки. Лікування ерастином2 (1 мкМ) було позитивним контролем щодо ферростатину-1-залежного інгібування ферроптозу. Клітини були зображені на Ессенському інкуситовому зумі (Ann Arbor, MI) та проаналізовані, як описано (Forcina et al., 2017). Для кожного стану було проведено три незалежні біологічні експерименти.

C11 581/591 Візуалізація ТІЛА

За день до експерименту 125 000 клітин HT-1080/лунку висівали в 6-лункові планшети (Cat # 3516, Corning) з однією 22 мм 2 ні. 1,5 скляного покривного ковзанка в кожній лунці. Наступного дня клітини обробляли носієм (етанолом) або DGLA (500 мкМ) та ДМСО або ферростатином-1 (1 мкМ) у середовищі росту HT-1080 при 37 ° С протягом 8 год. Через 8 год середовище видаляли і клітини обробляли C11 BODIPY 581/591 (Cat # D3861, Molecular Probes, Eugene, OR; кінцева концентрація = 5 мкМ) та Hoechst (Cat # H1399, Molecular Probes; кінцева концентрація = 1 мкг/мл), розчинений у HBSS та інкубуваний при 37 ° C протягом 10 хв. Через 10 хв суміш C11 BODIPY 581/591/Hoechst видаляли і до клітин додавали свіжий HBSS. Кожне покриття було видалено та встановлено у 25 мкл HBSS на предметне скло мікроскопа. Клітини знімали за допомогою мікроскопа Zeiss Axio Observer з конфокальною обертовою дисковою головкою (Йокогава, Токіо, Японія), об'єктивом занурення в масло PlanApoChromat 63 ×/1,4 NA та CCD-камерою Cascade II: 512 з електронним множенням (ЕМ) (фотометрика, Тусон, Арізона). Зображення оброблялись у ImageJ 1.48v. Візуалізацію проводили на двох незалежних біологічних копіях для кожного стану лікування.