Багата цукрозою дієта викликає мутації товстої кишки

Анотація

ВСТУП

Композиція корму для тварин у чотирьох дозових групах

Окислений білок і MDA. 2

Близько 0,3 г подрібненої печінки гомогенізували протягом 10 с за допомогою гомогенізатора Ultra-Turrax T25 (Janke Kunkel GMBH, Штауфен, Німеччина) в 3 мл 0,25 м сахарози і центрифугували при 9000 × g, а цитозольну фракцію отримували осадженням кальцію (18). Фракції плазми та цитозолю з печінки аналізували на окислені залишки лізину (AAS) та на окислені залишки проліну або аргініну (γ-глутамілсеміальдегід) у білках, як описано Daneshvar та співавт. (19). Білок визначали на аналізаторі Cobas Mira + за допомогою комерційного набору (номер каталогу 0736783; Roche, Базель, Швейцарія).

Загальний MDA у плазмі визначали методом ВЕРХ, як описано Лаурідсеном та Мортенсеном (20) .

Антиоксидантні ферменти.

Автоматизовані аналізи антиоксидантних ферментів SOD, GPx, CAT та GR у лізованих еритроцитах проводили на аналізаторі Cobas Mira. SOD (каталожний номер Randox SD 125) та гемоглобін (каталожний номер Randox HG 980) визначали за допомогою комерційно доступних наборів, тоді як активність GR визначали методом Голдберга та Спонера (21). Активність GPx, використовуючи трет-бутилгідропероксид як ініціатор, та активність CAT визначали згідно з методом, описаним Wheeler et al. (22). Ферментативну активність в еритроцитах розраховували щодо кількості гемоглобіну.

Вітамін С у плазмі та печінці.

Плазму (200 мкл) та гомогенат печінки (300 мг) негайно обробляли метафосфорною кислотою, як описано раніше, і зберігали максимум 3 місяці при -80 ° C перед аналізом ВЕРХ на аскорбат та дегідроаскорбат (23) .

Ізоляція клітин з печінки і ободової оболонки.

Виділення клітин печінки по суті проводили, як описано раніше (24). Клітини слизової оболонки товстої кишки зішкребали з розморожених шматочків товстої кишки скляним предметним склом мікроскопа і поміщали в крижаний розчин Merchant-EDTA [0,14 м NaCl, 1,47 мм KH2HPO4, 2,7 мм KCl, 8,1 мм Na2HPO4, 10 мм NaH2PO4 та 10 мм NaEDTA (рН 7,4); Посилання 25] .

Аналіз мутацій.

Клітини товстої кишки та печінки суспендували у 2 мл Merchant-EDTA шляхом піпетування вгору та вниз тричі. Близько 20 мільйонів клітин фільтрували через ситечко для клітин (Falcon; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), а ДНК очищали набором для ізоляції ДНК RecoverEase (Stratagene, La Jolla, CA). ДНК із приблизно 60 мг замороженої печінки готували RecoverEase, як описано виробником (Stratagene). Препарат ДНК (8 мкл) упаковували з екстрактом упаковки Transpack (Stratagene). Якщо пакувальна суміш була в’язкою після рекомендованого стандартного часу пакування 180 хв, суміш інкубували ще 60 хв. Якщо суміш після цього часу все ще була в’язкою, додавали додаткові реагенти Transpack, і суміш інкубували ще 60 хв. Цей фаговий препарат був використаний для зараження кишкової палички G1250 (hfl -). Фаги з мутаціями в локусі cII ідентифікували шляхом утворення нальоту в селективних умовах росту при 24 ° C, а загальну кількість інфекційних фагів визначали утворенням бляшок в неселективних умовах росту при 37 ° C, як описано (λ Select-cII ™ Mutation Система виявлення великих блакитних гризунів; Stratagene).

Аналіз SCGE.

Виявлення пошкодження ДНК в одиничних клітинах печінки та товстої кишки проводили, як описано раніше (24). Рівень чутливих до EndoIII сайтів був отриманий як різниця в балах паралельних предметних стекол, інкубованих із ферментами EndoIII та без них при 37 ° C протягом 45 хв [фермент EndoIII був своєрідним подарунком від Сержа Бойте (UMR217 Center National de la Recherche Scientifique et Commissariat a l'Energie Atomique, Fontenay aux Roses, Франція)]. Для кожного зразка було відібрано 50 зображень за допомогою програмної системи Kinetics Imaging Limited (Ліверпуль, Великобританія) Версії 4 для визначення кількості ДНК, яка мігрувала від голови комети до хвоста.

Виявлення 8-oxodG.

Рівні 8-oxodG щодо дезоксигуанозину вимірювали в клітинах слизової оболонки товстої кишки та печінки за допомогою ВЕРХ з електрохімічним виявленням після виділення та перетравлення ядерної ДНК, як описано в інших роботах (26). Концентрації 8-oxodG у сечі вимірювали за допомогою ВЕРХ із тандемною мас-спектрометрією, як описано в інших місцях (27) .

32 P Аналіз після маркування.

ДНК екстрагували з подрібненої печінки та клітин слизової оболонки товстої кишки за допомогою стандартної процедури екстракції фенолом/хлороформом, і аналіз після маркування 32 P проводили, як описано раніше (28), використовуючи екстракцію бутанолу як процедуру збагачення. Стандарт, що складається із модифікованої бензо (а) пірен-діол-епоксид-модифікованою пірео-епоксидом ДНК тимусу теляти, використовувався для корекції повсякденних змін у аналізі. Результати виражаються як аддукти/10 8 нуклеотидів, виходячи із середнього значення двох незалежних аналізів.

Кількісна оцінка rERCC1 і rOGG1 Рівні мРНК у товстій кишці та печінці.

Загальну РНК очищали від 10 мг печінки або від 5 × 10 6 клітин товстої кишки за допомогою набору для очищення загальної РНК Qiagen, як рекомендовано виробником. РНК обробляли ДНКазою, як рекомендував Qiagen. Подальший контроль якості показав, що всі геномні забруднення були видалені обробкою ДНКазою. Цілісність РНК перевіряли за допомогою гель-електрофорезу, як описано раніше (29). РНК (200 нг) використовували для синтезу кДНК в реакційному обсязі 10 мкл, використовуючи комплект зворотної транскрипції-ПЛР Taqman Gold, як рекомендували PE Biosystems. Для кількісної оцінки рівнів мРНК використовували зонди Такмана. Для rERCC1 використовували такі олігонуклеотиди: (a) прямий праймер (53F), 5′-cctgggaaggacgaggaaa-3 ′; (b) зворотний праймер (121R), 5′-tgggataacaaacttcttcctggt-3 ′; та (c) зонд Такмана (74T), 5′-FAM-cggccacagccctcaggacc-TAMRA-3 ′ (TAGCopenhagen). Для rOGG1 використовували такі олігонуклеотиди: (а) зонд Такмана, 5′-FAM-TCATGCCCTGGCTGGTCCAGAAG-TAMRA-3 ′; (b) прямий праймер, 5′-ACTTATCATGGCTTCCCAAACC-3 ′; та (c) зворотний праймер, 5′-CAACTTCCTGAGGTGGGTCTCT-3 ′. Цей зонд не є специфічним для OGG1 щурів і, ймовірно, виявляє як ядерну, так і мітохондріальну мРНК OGG1 у різних видів.

Реакції ПЛР проводили в двох примірниках або в трьох примірниках в системі виявлення послідовностей ABI 7700 в реакціях 15 мкл, що містять 200 нм праймерів, 300 н м зонд Такмана та 0,1 мкл кДНК в 1 × Mastermix (PE Biosystems). Для нормалізації 18S мРНК визначали кількісно в окремій реакції ПЛР, використовуючи попередньо розроблений аналітичний реагент для ендогенного контролю для кількісного визначення 18S РНК (PE Biosystems) у двох або трьох примірниках. Для кожної тварини середнє значення кількісних показників rERCC1 ділили на середнє значення кількісних характеристик 18S РНК.

Сигнали від rERCC1, rOGG1 та 18S РНК були лінійними при 100-кратному розведенні (дані не наведені). Аналогічним чином, нормалізація сигналу rERCC1 до 18S РНК дала той самий сигнал при 100-кратному розведенні (дані не показані). Повторні вимірювання одного і того ж зразка давали СД 20% між партіями. SD на три екземпляри становила в середньому 15%.

Апоптоз.

Вимірювання клітинної проліферації в печінці.

Загальну кількість гепатоцитів і кількість клітин з чітким ядерним фарбуванням PCNA підраховували за допомогою стандартного світлового мікроскопа (Leica DMR, Wetzlar, Німеччина), підключеного до цифрової камери (Leica DC 100), що передає зображення на 17-дюймовий екран . Гепатоцити зі слабким і зернистим забарвленням ядра або з цитоплазматичною реакцією не були включені; тому позитивні клітини в основному представляють клітини у фазі S мітозу (30). Зразки печінки були засліплені для спостерігача. Для кожної проби печінки гепатоцити підраховували в 15–20 систематичних випадково вибраних полях. Коротше кажучи, кожне поле було обрано, рухаючись через зразок тканини за меандром зі збільшенням × 100, дбаючи про те, щоб поля не перекривались; Потім збільшення було змінено на × 630 для підрахунку клітин. Щоб уникнути завищення, підраховували лише гепатоцити у фокусі та не торкаючись нижньої та лівої меж поля. Підраховували від 15 до 30 клітин/поле, і приблизно 360 клітин/тварину. Відсоток гепатоцитів, які фарбують позитивно на PCNA, визначали як кількість позитивних гепатоцитів/зразок, поділену на загальну кількість гепатоцитів/зразок × 100.

Статистика.

Всі параметри перевіряли на нормальний розподіл за допомогою тесту Колмогорова-Смирнова (Р> 0,01). Однорідність дисперсії між групами оцінювали шляхом оцінки стандартних залишкових графіків (процедура загальної лінійної моделі, Статистичний пакет SAS, випуск v8; SAS Institute Inc., Cary, NC). Деякі параметри повинні були бути логарифмічно перетворені, щоб відповідати кожному критерію. Групи порівнювали за допомогою одностороннього ANOVA. Якщо спостерігались суттєві відмінності (P ⇓). Через дещо більший фактичний обсяг споживання корму в групах із низькими та середніми дозами не було зменшення споживання інших компонентів корму в цих групах. Оскільки всі компоненти корму, крім сахарози, тварини в кожній групі споживали у пропорційних кількостях, ЕІ та НІ були розраховані шляхом встановлення медіани контрольної групи на 100 (див. Таблицю 2). У групі високих доз спостерігалося значне зниження NI, що вказує на те, що споживання всіх мікроелементів, казеїну, крохмалю, соєвої олії та целюлози зменшилось майже на 30% порівняно з контролем (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Прийом корму, збільшення маси тіла та кінцева вага тіла

Вплив на мутацію, пошкодження ДНК та відновлення.

Дозозалежне збільшення спостерігалось при мутаціях ІСІ слизової оболонки товстої кишки (Р = 0,0017), тоді як на печінку це не впливало (Р = 0,61; див. Рис. 1 ⇓). Окремі титри фагів та частоти мутацій наведені в таблиці 3 ⇓. Формування аддукту ДНК, визначене за допомогою позначення 32 P, було залежно від дози та суттєво зменшене збільшенням дієтичної сахарози в товстій кишці, тоді як печінка не зазнала впливу (див. Рис. 2 ⇓). Не було впливу сахарози на рівень 8-oxodG, розриви ланцюгів або чутливі до EndoIII ділянки в ДНК в товстій кишці або печінці. Сахароза не впливала на здатність до відновлення ДНК товстої кишки, визначену рівнями мРНК rERCC1 або rOGG1. Кореляційний аналіз Пірсона маркерів товстої кишки виявив значні зворотні асоціації мутацій з аддуктами (r 2 = 0,56; P 2 = 0,55; P 2 = 0,13; P = 0,56). Також спостерігали позитивну асоціацію в експресії двох репаративних ферментів (r 2 = 0,52; P = 0,01).

Рівні аддукту ДНК в товстій кишці () та печінці (□) визначають за допомогою 32 P-маркування. Стовпчики представляють засоби, а рядки позначають 1 SD. Групи, які суттєво відрізняються (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Частота мутацій (MF) та загальна кількість фагів, упакованих для кожної тварини для товстої кишки та печінки

Рівень rERCC1 печінки, але не рівень мРНК rOGG1 суттєво впливав, як було визначено ANOVA, але лише група найнижчих доз відрізнялася від контролю (див. Таблицю 4). Не було жодної кореляції між утворенням аддуктів, частотою мутацій та експресією ферменту, що відновлює ДНК, у печінці.

Маркери окисного пошкодження та захисту

Загального впливу на окислювальну шкоду ДНК не спостерігалося, як визначали виведення з сечею 8-оксидG (Р = 0,37).

Інші маркери окисного стресу.

Окрім маркерів, пов’язаних з ДНК, у відділі печінки та крові також досліджувались інші маркери окисного стресу (див. Таблицю 4). Маркери представляють пошкодження білків та ліпідів. Обробка сахарозою не впливала на рівень окиснення білка в цитозольних білках. Окислення білків плазми та окислення ліпідів також не зазнали змін.

Маркери окислювального захисту.

Рівень аскорбату в печінці у щурів суттєво впливав на лікування сахарозою (див. Рис. 3). Як знижений (Р = 0,04), так і загальний (Р = 0,02) рівень вітаміну С був значно підвищений у печінці, а їх різниця, що представляє дегідроаскорбінову кислоту, також була підвищена (Р = 0,02). У плазмовому відділенні сахароза не впливала на окислений, відновлений та загальний рівні аскорбату.

Вплив дієтичної сахарози на маркери, пов’язані з регуляцією клітинного циклу

Експресію Cox2 визначали в товстій кишці, щоб оцінити, чи може арахідонатний шлях брати участь в опосередкованих сахарозою ефектах у товстій кишці. У цьому дослідженні не було впливу впливу сахарози на експресію Cox2 (див. Таблицю 5), а кореляційний аналіз Пірсона не виявив взаємодії з будь-яким іншим маркером у товстій кишці.

ОБГОВОРЕННЯ

Раніше було встановлено, що сахароза та фруктоза, на відміну від глюкози або крохмалю, спричиняють збільшення маси печінки щурів та гіперплазію після 90-денного періоду годування (48). Після 3-тижневого періоду годування ми не спостерігали значної різниці у вазі печінки, проліферації клітин або апоптозі між групами контролю та групою з найвищою дозою. Однак вага печінки та апоптоз суттєво корелювали.

У цьому дослідженні сахароза витіснила всі інші компоненти корму, включаючи картопляний крохмаль, який частково стійкий до травлення в тонкому кишечнику. У групах із низькими та середніми дозами фактичне споживання їжі було трохи збільшено, компенсуючи знижений вміст картопляного крохмалю та поживних речовин у кормах, і навіть у цих групах ефект сахарози був очевидним. У групі високих доз споживання всіх поживних речовин та мікроелементів зменшилось на 28% через витіснення сахарозою. Однак загальний енергозабір у чотирьох групах був однаковим. Тому менш імовірно, що ефекти, що спостерігаються на мутації та аддукти ДНК, зумовлені зменшенням стійкого крохмалю чи інших захисних дієтичних факторів, а не збільшенням споживання сахарози як такої. Щоб побачити, чи багата на сахарозу дієта спричиняє мутації нового типу уражень чи, швидше, збільшення фонової швидкості мутацій, ми в даний час аналізуємо мутаційні спектри фонових та індукованих сахарозою мутацій у місці ІІІ в товстій кишці.

Ми прийшли до висновку, що багата сахарозою дієта викликає мутації епітелію товстої кишки щурів і одночасно спричинює зменшення I-сполук товстої кишки. Подібного ефекту на печінку не спостерігалося, але слабкий ефект, можливо, маскувався відносно коротким часом годування в цьому дослідженні. Далі ми робимо висновок, що, хоча рівень аскорбату в печінці зріс із збагаченою сахарозою дієтою, окислювальний механізм, який лежить в основі дієти, багатої сахарозою, малоймовірний.

Виноски

Витрати на публікацію цієї статті були частково сплачені за рахунок оплати сторінок. Тому ця стаття повинна бути цим позначена як реклама відповідно до 18 U.S.C. Розділ 1734 виключно для зазначення цього факту.

↵ 1 Кому слід адресувати запити на передрук, в Інституті безпечності та харчування харчових продуктів, Відділ біохімічної та молекулярної токсикології, Датське управління ветеринарії та харчових продуктів, Mørkhøj Bygade 19, DK-2860 Søborg, Данія.

↵ 2 Використовуються скорочення: MDA, малоновий діальдегід; AAS, 2-аміноадипіновий напівальдегід; CAT, каталаза; FAM, 6-карбоксифлуоресцеанамін сукцимідилестер; GR, глутатіонредуктаза; GPx, глутатіонпероксидаза; PCNA, проліферуючий клітинний ядерний антиген; СОД, супероксиддисмутаза; SCGE, одноклітинний гель-електрофорез; ТАМРА, 6-карбокситетраметилродамін сукцимідилестер; TUNEL, кінцеве маркування дезоксинуклеотидилтрансферази, опосередковане біотинільованим дезоксиуридин трифосфатом; ВЕРХ, високоефективна рідинна хроматографія; 8-оксодG, 8-оксодезоксигуанозин; ЕІ, енергетичний індекс; NI, індекс поживних речовин; ЕндоIII, ендонуклеаза III.

Надійшла 14 січня 2002 року.
Прийнято 24 травня 2002 року.