Частка пухлин ендометрія, пов’язаних із синдромом Лінча (ПЕТАЛИ): Проспективне поперечне дослідження

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Збір коштів, Розслідування, Написання - оригінальний проект, Написання - огляд та редагування

Афіліаційний відділ ракових наук, Факультет біології, медицини та охорони здоров’я, Університет Манчестера, лікарня Сент-Мері, Манчестер, Великобританія, Відділ еволюції та геномної медицини, Університет Манчестера, Лікарня Св.

Ролі Курація даних, розслідування, написання - огляд та редагування

Афілійований відділ патології, Манчестерський університет, Фонд NHS Foundation Trust, Манчестерський академічний науковий центр охорони здоров'я, Манчестер, Великобританія

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Написання - огляд та редагування

Філія Манчестерський центр геномної медицини, Центр лабораторії північно-західної геноміки, Манчестерський університет Фонд NHS Foundation, Манчестерський академічний науковий центр охорони здоров'я, Манчестер, Великобританія

Ролі Формальний аналіз, Написання - оригінальний проект, Написання - перегляд та редагування

Affiliation Health Economics Group, University of Exeter Medical School, University of Exeter, Exeter, Devon, United Kingdom

Ролі Адміністрація проекту, ресурси, написання - огляд та редагування

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Написання - огляд та редагування

Ролі Курація даних, написання - огляд та редагування

Ролі Адміністрація проекту, Написання - огляд та редагування

Афілійований відділ наук про рак, Факультет біології, медицини та охорони здоров’я, Університет Манчестера, лікарня Сент-Мері, Манчестер, Великобританія

Ролі Курація даних, написання - огляд та редагування

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Написання - огляд та редагування

Дослідницька група синдромів пухлинних спадкових зв'язків, Інститут раку та генетики, Кардіфський університет, Кардіфф, Великобританія

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Написання - огляд та редагування

Порівну сприяли цій роботі разом з: Д. Гаретом Евансом, Еммою Дж. Кросбі

Ролі Концептуалізація, курація даних, офіційний аналіз, придбання фінансування, нагляд, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Відділ еволюції та геномної медицини, Манчестерський університет, лікарня Сент-Мері, Манчестер, Великобританія, Манчестерський центр геномної медицини, Центр лабораторії північно-західної геноміки, Манчестерський університет, Фонд NHS Foundation, Манчестерський академічний науковий центр охорони здоров'я, Манчестер, Великобританія

Порівну сприяли цій роботі разом з: Д. Гаретом Евансом, Еммою Дж. Кросбі

Відділ з питань ракових захворювань, Факультет біології, медицини та охорони здоров'я, Манчестерський університет, лікарня Сент-Мері, Манчестер, Великобританія, Департамент акушерства та гінекології, лікарня Сент-Мері, Манчестерський університет Фонд NHS Foundation, Манчестерський академічний науковий центр охорони здоров'я, Манчестер, Об'єднане Королівство

Ніл А. Дж. Райан,
Реймонд Макмехон,
Саймон Тобі,
Трістан Сноусілл,
Шона Ескібель,
Ендрю Дж. Уоллес,
Санча Банстоун,
Наомі Бауерс,
Іоана Е. Моснег,
Сара Дж. Кітсон

Цифри

Анотація

Передумови

Синдром Лінча (LS) схильний до раку ендометрія (EC), колоректального раку та інших видів раку через успадковані патогенні варіанти, що впливають на гени невідповідності (MMR). Діагностування ЛС у жінок з ЕК може зменшити подальшу смертність від раку за допомогою колоноскопічного нагляду та хіміопрофілактики аспірину; це також дозволяє проводити каскадне тестування родичів. Зростаючий консенсус підтримує скринінг LS в ЄС; однак очікувана частка позитивних результатів тестування та оптимальна стратегія тестування є невизначеною. Попередні дослідження систем охорони здоров’я, заснованих на страхуванні, обмежувались вузькими критеріями відбору, нездатністю постійно застосовувати еталонні стандартні тести та поганим переходом на остаточне тестування. Метою цього дослідження було встановити поширеність LS та діагностичну точність стратегій тестування LS у невибраній популяції ЕС.

Методи та висновки

Методи

Протокол дослідження

Частка пухлин ендометрія, пов’язаних із синдромом Лінча (PETALS), була спонсорована Університетом Манчестера, Сполучене Королівство, та схвалена Північно-Західним комітетом з питань етики (15/NW/0733; протокол S1). Дослідження було зареєстровано в перспективі (Cancer Research-UK, база даних клінічних випробувань, ref-13595). Про це повідомляється згідно з керівництвом щодо посилення звітності спостережних досліджень в епідеміології (STROBE) (S1 Контрольний список), а також надається первинний набір даних (S1 Дані).

Учасники

Жінок набирали з гінекологічних клінік у Манчестерському університеті NHS Foundation Trust (MFT), великому гінекологічному центрі раку, з жовтня 2015 р. По січень 2017 р. Жінки, яким діагностовано ЕК або атипову гіперплазію (АГ) протягом попередніх 5 років, мали право приймати на роботу без демографічних показників або гістологічні обмеження. АГ був включений для фіксації повного спектру новоутворень ендометрія. Усі жінки дали письмову, поінформовану згоду на участь, надавши ДНК крові, пухлини та клінічні дані (вік, індекс маси тіла [ІМТ], етнічна приналежність, про яку повідомили самі), включаючи детальну сімейну історію (родовід). Останні оцінювались за допомогою переглянутих Bethesda [19], Amsterdam II [20] та Prediction of MMR Gene Mutations-v.5 балів (PREMM5) [21]. Додаткові зразки були закуплені у жінок з ЕК, які дали згоду на свої клінічні дані, пухлини та ДНК, які будуть використовуватися для подальших досліджень у період з 2013 по 2014 рік на MFT; їх деталізованих родоводів не було.

Соматичний аналіз пухлини

Зразки гістеректомії та біопсії були оцінені 2 спеціалістами-гінекологами згідно з критеріями стадії FIGO-2009 (EC) та системою класифікації ВООЗ (AH). Повідомлялося про інфільтрацію лімфоцитами стромальної пухлини (ТІЛ), як описано раніше [22]. Молекулярне профілювання пухлини використовувало зразок гістеректомії, коли це було можливо, але діагностичні зразки ендометрія використовували, коли гістеректомія не проводилася або коли неоднозначний ІГХ повторювався. Вся тканина була закріплена формаліном та вбудована у парафін згідно з місцевими клінічними протоколами. Для екстракції ДНК були обрані тканинні блоки з найбільшим вмістом пухлини (> 70%). Пухлина або мікродисекціонувалась із незабарвлених зрізів 5 × 10 мкм, або одержувала серцевину з тканинних блоків, залежно від вмісту пухлини. Незлоякісну сусідню тканину відібрали для порівняльного конституційного аналізу MSI.

IHC для білків 4 MMR проводили з використанням автоматизованого модуля фарбування Ventana BenchMark ULTRA IHC⁄in situ hybridisation (ISH) та системи виявлення OptiView, 3'діамінобензидин версії 5 (Ventana Co., США) в лабораторії, яка успішно бере участь у зовнішній забезпечення якості (EQA; UK NEQAS ICC and ISH, Модуль 7B; https://www.ukneqasiccish.org; S1 Text). Частка забарвленого компонента пухлинного епітелію та інтенсивність фарбування оцінювали 2 незалежні експерти, які використовували строму пухлини як внутрішній контроль, як описано раніше [23]. Приклади повної та "нерівномірної" втрати білка MMR проілюстровані в тексті S1.

Аналіз MSI (і MLH1-метилювання) проводили в акредитованій UKAS ISO15189 акредитованій референтній лабораторії тестування MSI, яка успішно бере участь у EQA (https://www.genqa.org). ДНК витягували і піддавали конверсії бісульфіту натрію за допомогою набору Epitect Plus FFPE (Qiagen, Великобританія). Система аналізу MSI версії 1.2 (Promega, США) використовувалась зі стандартизованими клінічними протоколами. Флюоресцентно-мічені праймери використовувались для коампліфікації 7 маркерів, включаючи 5 маркерів-повторювачів мононуклеотидів (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 та MONO-27), та 2 контрольних маркери повторного пентануклеотиду ( Penta-C/Penta-D). Статус MSI визначали 2 незалежні вчені. Ідентичні профілі фрагментів між пухлиною та відповідними нормальними тканинами для всіх 5 мононуклеотидних локусів вважали мікросателітним стабільним (MSS); невідповідність в одному мононуклеотидному локусі була низькою MSI (MSI-L). Розбіжність у 2 або більше локусах мононуклеотидів була високою MSI (MSI-H). Лише ті, у кого пухлини MSI-H, вважалися ризиком ЛС; це узгоджується з консенсусом експертів [15].

Аналіз метилювання.

Рефлекторне тестування MLH1-метилювання проводили на MLH1 та/або дефіцитах PMS2 та/або пухлинах MSI, як описано раніше [24]. Очищену ДНК ампліфікували бісульфітними специфічними праймерами у трьох примірниках. Промоторну область MLH1, що містить 4 динуклеотиди CpG, стан метилювання яких суттєво корелює з експресією MLH1, аналізували за допомогою піросеквенування (PSQ 96MA). Два незалежні вчені інтерпретували пірограми. «Гіперметилювання» описувало> 10% середнього метилювання у 4-х CpG-динуклеотидах на більш ніж двох третинах повторних аналізів. Частина випадків гіперметилювання MLH1 зазнала еталонного стандартного секвенування зародкової лінії MMR для виключення співіснуючих варіантів path_MLH1.

Аналіз зародкових ліній

Показаннями до аналізу зародкових ліній були вік 10%; та орієнтовні молекулярні особливості пухлини, зокрема дефіцит MMR (MMRd, втрата епітелію пухлини ≥1 білка MMR на IHC) та/або MSI-H, що не пояснюється соматичним MLH1-гіперметилюванням.

Тестування на метилювання проводиться лише в тому випадку, якщо ≥1 MLH1 або PMS2 було втрачено в результаті імуногістохімії. "Відсутність метилювання" означає, що воно не вказувалося. # PMS2 перевіряється лише в тому випадку, якщо PMS2d і немає path_MLH1, path_MSH2 або path_MSH6. ^ Один із зразків MSI-H не проходив тестування на зародкові лінії, оскільки пацієнт помер до того, як можна було взяти кров. MSI, нестабільність мікросупутника; MSS, мікросателітний стабільний; MMR, виправлення невідповідностей; MMRp, MMR досвідчений (відсутність втрати білка MMR); MMRd, MMR дефіцитний (≥1 білка MMR втрачено).

Частка пухлин, асоційованих з ЛС

Ми виявили 16 варіантів носіїв ЯМР-шляху, що дало 3,2% загальної поширеності LS (95% ДІ 1,84% –5,14%). Було 8 шляхів_MSH6, 4 шлях_MSH2, 2 шлях_MLH1 та 2 шляху_PMS2 варіантів носіїв (Таблиця 2). Троє знали ЛС, 2 померли незабаром після діагностики ЕК, а решті 11 запропонували, з яких 10 прийняли генетичне консультування. На сьогодні 14 родичів також отримали генетичну консультацію. Одна жінка несла 2 VUS_MSH6, які вважаються патогенними у поєднанні (текст S2). Ще 10 жінок мали варіанти MMR, які не були розпізнані InSiGHT (https://www.insight-group.org), у тому числі 5 раніше не повідомлених варіантів (текст S3). Найбільша розбіжність між висновками IHC та MSI спостерігалась у тих, у кого варіант зародкової лінії_MSH6 з 5/8 демонструє втрату MSH6 на IHC, але MSS. Один варіант_MSH6 (MSH6 c.2731C> T p. (Arg911Ter) спостерігався у 3 індексних випадках, і тому міг представляти місцеву мутацію засновника; однак, огляд місцевої клінічної бази даних вказує, що цей варіант зачіпає лише 5/487 місцевих сімей LS.

Відбір жінок для тестування зародкової лінії LS

Вік та сімейна історія.

Загалом було 73 жінки ≤50 років, з них 7 (10%) мали ЛС. Усі 7 мали показові молекулярні особливості пухлини (MMRd ± MSI-H). Тільки скринінг жінок Таблиця 3. Точність діагностичного тесту клініко-патологічних критеріїв відбору та стратегій сортування на основі пухлини.

Вичерпні дані про родовід були доступні для 300 жінок. Лише 7/300 (2%) та 9/300 (3%) жінок з детальним родоводом відповідали критеріям Amsterdam II та переглянули рекомендації Bethesda, з них 4 (57%) та 5 (56%) мали ЛС відповідно. Усі жінки з ЛС також мали показові молекулярні особливості пухлини. Загальний середній бал PREMM5 становив 3,2% (SD 2,4%). Загалом 164/299 (55%) жінок мали показники, які перевищували рекомендований показник для 2,5% для тестування на зародкові лінії, середній бал PREMM5 становив 4,3% у цій підгрупі, а 11 (6,7%) мали ЛС. Ще 12 жінок з пухлинами, що володіють MSS/MSI-L, що володіють MMR, пройшли тестування на зародкові лінії через попередній рак, асоційований з LS (n = 3), або орієнтовний сімейний анамнез (включаючи Амстердам II [n = 2], переглянутий Bethesda [n = 4] та PREMM5> 10% [n = 3]). Жоден не містив варіанту path_MMR або VUS_MMR.

Дефіцит MMR за ІГХ.

Загалом 132/500 (26%) пухлин мали дефіцит MMR (табл. 4), з них 83 - MSI-H. Жінки з пухлинами з дефіцитом MMR були старшими за тих, хто не втратив MMR (середня різниця 3,3 року, t-тест [нерівні дисперсії] p = 0,007). З 24 жінок, які мали пухлини з нерівними втратами MMR, одна мала зародкову лінію VUS_MMR, але жодна з них не мала ЛС. В одному випадку MSS AH спостерігалася нерівна втрата MSH6, і згодом було встановлено, що він має VUS_MSH6, але всі інші зразки AH мали інтактний MMR. Тринадцять пухлин не вдалися з першої спроби, але не повторили тестування MMR-IHC.

MSI-аналіз.

Загалом 89/500 (18%) пухлин були MSI-H та 21/500 (4%) - MSI-L. Жодна з 6 MSI-H MMR-досвідчених пухлин не була LS-асоційованою (табл. 4). Жінки з пухлинами MSI-H були старшими за жінок з пухлинами MSS (середня різниця 4,7 року, p 70 років.

У нашому дослідженні було 5 ключових сильних сторін. По-перше, ми набрали 99% жінок, які відповідають вимогам, забезпечуючи неупереджену популяцію послідовних пацієнтів, необмежених за віком, гістологічним підтипом або способом лікування. Раніше повідомлялося про рівень набору персоналу близько 50%, головним чином із систем охорони здоров’я, що базуються на страхуванні [28]. По-друге, всі пухлини проходили тестування на MMR-IHC, MSI та цільове тестування на метилювання MLH1, а всі жінки, крім однієї, з орієнтовними ознаками пухлини проходили тестування на зародкову лінію_MMR. Це вигідно порівняно з більшістю досліджень з неповним тестуванням [13] і дозволило нам перевірити критерії відбору та стратегії сортування на основі пухлини. По-третє, всі аналізи проводились з урахуванням якісних клінічних стандартів у спеціалізованих лабораторіях з патології та генетики. По-четверте, всі, крім 2 із 106 (1,9%) пухлин з дефіцитом MMR, пояснювались MLH1-гіперметилюванням, соматичною мутацією MMR або LS. По-п’яте, наше включення АГ, що є частиною спектру LS-EC [36], є незвичним, але виправданим, оскільки виявлення ЛС у жінок з АГ не тільки підтримує майбутні заходи, що знижують ризик, але також впливає на їх негайні рішення щодо лікування.

Наші висновки підтверджують невибраний скринінг ЕК на ЛС. Ми показуємо, що вік, сімейний анамнез та патологічні дані мають обмежене значення при відборі жінок для тестування. Універсальне тестування на зародкові лінії неможливо з фінансової точки зору [37], що вимагає сортування на основі пухлини. Як найкраще цього досягти, це спірне питання, але переважаюча мудрість полягає в тому, що MSI та IHC є рівнозначними [29], незважаючи на обмежені докази цього [15]. Наші дані дають вагомі докази того, що MMR-IHC із цільовим тестуванням на метилювання MLH1 перевершує тестування на основі MSI в ЄС. Це зменшує частку жінок, які потребують послідовності зародкових ліній, не пропускаючи жодного випадку, знижуючи витрати [37] та покращуючи економічну ефективність [38, 39]. Виявлення ЕМ з дефіцитом MMR має клінічне значення. Це дозволяє клініцистам адаптувати лікування [40], пояснювати прогноз [40], прогнозувати рецидив раку [41] та індивідуалізувати спостереження [41]. Крім того, жінки хочуть пройти тестування; вражає те, що 99% жінок, які мають право на це, звернулися під час звичайної гінекологічної допомоги при раку, погодились взяти участь, а 10/11 нещодавно виявлених носіїв ЛС відвідали генетичне консультування та підтримали каскадне тестування членів сім'ї групи ризику.

Невибраний скринінг EC на LS призводить до відкриття VUS_MMR. Вони створюють клінічну загадку, оскільки нові варіанти можуть бути складними для класифікації. Дійсно, раніше 15 з 27 варіантів MMR не повідомлялись ні наборам даних ClinVar, ні InSiGHT. Це підкреслює необхідність міжнародних мультидисциплінарних груп експертів для вивчення клінічного значення VUS_MMR та/або інвестицій у платформи редагування генома насичення для аналізу високої пропускної здатності [15]. Така інфраструктура створена для інтерпретації варіантів MMR і відповідає всім клінічним лабораторіям для інтерпретації варіантів за єдиним набором визначених критеріїв (https://www.insight-group.org/criteria/) до того, як розпочнеться загальний скринінг на ЛС у ЄС.

Наскільки нам відомо, це на сьогодні всебічне дослідження, яке досліджує поширеність ЛС у невідібраній популяції ЄС, яка лікується в рамках системи страхування, що не базується на страхуванні. Згода на тестування на ЛС була прийнята гінекологами під час звичайної клінічної допомоги [42]. У цій когорті ми виявили, що IHC перевершує MSI як засіб сортування на основі пухлини та надійно ідентифікує як зародкові лінії, так і соматичні пухлини з дефіцитом MMR для забезпечення клінічної допомоги. Загальна поширеність LS в ЕК становила 3,2%, що порівняно з такою у CRC [30], і виправдовує аналогічну рекомендацію щодо невибраного скринінгу LS. Ми схвалюємо, коли ресурси дозволяють, універсальний скринінг EC на LS з використанням IHC, цільове тестування MLH1-метилювання та, де вказано, секвенування зародкових ліній для варіантів path_MMR.