Більш тривалий час контакту збільшує перехресне забруднення Enterobacter aerogenes від поверхонь до їжі

Пов’язані дані

АНОТАЦІЯ

Це дослідження мало на меті кількісно визначити перехресне забруднення між різними продуктами харчування та загальними кухонними поверхнями, змінюючи час контакту та бактеріальну матрицю, і робити це широко і всебічно. Описані тут результати просувають наше розуміння перехресного забруднення та факторів, що впливають на нього. Це дослідження інформує популярну культуру та покращує наше наукове розуміння перехресного забруднення та факторів, що впливають на нього.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Штам бактерій і підготовка культури.

Для всіх експериментів (Vivolac Cultures, Indianapolis, IN) використовували непатогенний харчовий мікроорганізм, Enterobacter aerogenes B199A, з характеристиками приєднання, подібними до характеристик сальмонели. Використовуваний тут штам E. aerogenes стійкий до налідиксової кислоти, що дозволяє проводити його перелік у присутності інших мікроорганізмів на зразках їжі або поверхнях. Контрольні експерименти (зроблені шляхом відбору зразків та посіву на триптичний соєвий агар [Difco, BD, Sparks, MD] з 50 мкг/мл налідиксової кислоти [Sigma Chemical Co., St. Louis, MO] [TSA-na]) показали, що налідиксинова кислота -резистентні клітини E. aerogenes спочатку не були присутніми ні в одній їжі або на поверхнях на рівні> 2 log КУО/поверхні або їжі.

Культури були підготовлені на основі попередньої роботи, проведеної в нашій лабораторії (13) та іншими (14). Заморожений запас E. aerogenes у 80% стерильному гліцерині наносили на TSA-na. Одну колонію з кожної пластини переносили в 10 мл триптичного соєвого бульйону (Bacto, BD, Sparks, MD) з 50 мкг/мл налідиксової кислоти (TSB-na) та інкубували при 37 ° C протягом 24 годин. Інокуляційні матриці були двох типів, в одній використовували клітини, зібрані центрифугуванням при 5000 × g протягом 10 хв і двічі промивали 10 мл 0,1% пептону (Difco, BD), а в одній використовували клітини, взяті безпосередньо з інокульованої культури TSB-na на ніч. Кінцеву концентрацію ~ 10 8 КУО/мл перевіряли шляхом підрахунку на TSA-na.

Підготовка побутових поверхонь.

Було використано чотири різні поверхні, типові для побутових середовищ: нержавіюча сталь (тип 304, товщина 0,018 дюйма, калібр 16; OnlineMetals, Сіетл, штат Вашингтон), керамічна глазурована плитка (Brancacci Windrift Beige; Daltile, Dallas, TX), деревина кленового ламінату (північний клен; Mohawk, Calhoun, GA) та внутрішній зовнішній килим (Morella; Foss Manufacturing, Hampton, NH). Їх замовили в Інтернеті або придбали у місцевому магазині дому. Поверхневі матеріали розрізали на купони (5 на 5 см). Купони з нержавіючої сталі та керамічної плитки дезінфікували перед щепленням, замочуючи в 70% етанолі протягом 1 години, видаляли, сушили на повітрі та автоклавували. Дезінфекція деревини та килимових купонів спричинила структурні зміни, тому вони були викинуті після автоклавування після одноразового використання.

Види їжі.

Чотири продукти (кавун, білий хліб [ShopRite, Wakefern Food Corp., Elizabeth, NJ], несолоне масло [ShopRite, Wakefern Food Corp., Елізабет, Нью-Джерсі] та клейкі цукерки [Haribo Strawberries]) були придбані в Інтернеті або у місцевого жителя супермаркет. Цілий кавун перед використанням зберігали при 4 ° C. Кавун (лише м’якоть) та хліб (крім скоринки) нарізали шматочками (приблизно 4 на 4 см). Несолене вершкове масло доносили до температури навколишнього середовища (∼24 ° C) перед тим, як намазувати його на хліб. Усі продукти мали рівноцінні площі контакту (~ 16 см 2). РН та активність води (aW) зразків вимірювали в трьох примірниках з поверхневим зондом pH (Accumet Basic AB15 pH-метр; Fisher Scientific) та aW-метром (Rotronic Instrument Corp., Hauppauge, NY) відповідно.

Перенесення між продуктами харчування та поверхнями.

Сценарії передачі оцінювали для кожного типу поверхні контакту (4), кожного типу їжі (4), чотирьох разів контакту та двох матриць посівних матеріалів, загалом 128 сценаріїв. Кожен сценарій повторювався 20 разів, загалом 2560 вимірювань. Кожному типу контактної поверхні плямисто інокулювали 1 мл інокуляту, використовуючи 8 - 10 крапель, розподілених по 5 - 5-сантиметровій поверхні. Поверхні поміщали в шафу з біобезпеки (SterilGARD Hood; The Baker Company, Inc., Sanford, ME) на 5 год, після чого поверхні були помітно сухими. До 5 годин поверхні були ще вологими, а часом і довше 5 годин, різниця у швидкості відновлення між матрицями інокуляту збільшувалась. Як пептоновий буфер, так і матриці инокулятів TSB-na давали приблизно суми 10% КУО/поверхню після висихання. Їжу скидали на відповідні поверхні за допомогою рук у рукавичках з висоти 12,5 см і залишали відпочивати протягом чотирьох різних часів (колонії E. aerogenes. Тарілки інкубували при температурі 37 ° C протягом 24 годин. Колонії підраховували і рівень популяції виражається в кількості КУО на харчову або поверхневу пробу.

Аналіз даних.

Відсоток передачі обчислювали наступним чином: [загальна кількість їжі КУО/(загальна кількість їжі КУО + загальна поверхня КУО)] × 100. Відсотковий коефіцієнт передачі від поверхні до їжі реєстрували за допомогою Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA) та SigmaPlot (Systat Software Inc., Сан-Хосе, Каліфорнія), оскільки попередні дослідження показали, що нетрансформовані швидкості передачі дуже перекошені, а трансформовані в журнал швидкості передачі приблизно нормально розподілені (13, 31). Коли продукти містять менше межі виявлення (2 log КУО), швидкість передачі розраховувались так, ніби концентрація на продуктах була на межі виявлення. Змінні та взаємодія між змінними вважалися значущими при значенні Р у таблиці 1. Кавун мав найвищий середній показник серед усіх досліджених продуктів. Хліб та масло вимірювали середні значення води, близькі до значень кавуна. AW клейкої цукерки була значно нижчою, ніж у інших вимірюваних харчових продуктів (0,72 проти ≥0,95). У вершковому маслі був найвищий рН (6,25) серед будь-якої із виміряних харчових продуктів, а у гумових цукерок - найнижчий (2,80). Хоча, як відомо, низький рН спричиняє стрес для мікроорганізмів, навряд чи, враховуючи короткий час контакту в цьому дослідженні, це могло б статися в експериментах з клейкими цукерками (32). Виміряні значення рН хліба та кавуна були проміжними (5,80 та 5,43 відповідно).

ТАБЛИЦЯ 1

Вимірювання pH та aW чотирьох харчових продуктів, до яких бактерії E. aerogenes переносяться із звичайних побутових поверхонь

Тип їжі: Середнє середнє значення ± SD Середнє значення pH ± SD

Хліб	0,95 ± 0,01	5,80 ± 0,02
Вершкове масло	0,97 ± 0,01	6,25 ± 0,03
Клейка цукерка	0,72 ± 0,01	2,80 ± 0,03
Кавун	0,99 ± 0,01	5,43 ± 0,01

Статистичний аналіз швидкості передачі.

ТАБЛИЦЯ 2

Багаторазовий лінійний регресійний аналіз результатів впливу часу контакту, матриці посівного матеріалу, типу їжі та типу поверхні та їх взаємодії на перенесення E. aerogenes із загальнопобутових поверхонь на харчові продукти

Змінна або коефіцієнт взаємодіїSELCL b UCL c t статистикаP значення

Перехопити	0,38	0,09	0,20	0,56	4.18	0,000030
Час	0,01	0,00	0,01	0,01	13.40	a Кількісні значення отримали наступні змінні: поверхня (плитка [0], нержавіюча сталь [1], дерево [2] та килим [3]), їжа (хліб [0], хліб з маслом [1], гуммічний цукерки [2], і кавун [3]), і матриця інокуляту (TSB [0] і буфер [1]).

Перенесення бактерій з інокульованих поверхонь на кавун, хліб, хліб з маслом та клейкі цукерки наведено у таблицях S1 - S4 у додатковому матеріалі відповідно. У кожній таблиці наведено шість різних статистичних параметрів, які використовувались для характеристики швидкості передачі журналу: середнє значення (x ̄), медіана (M), стандартне відхилення (σ), мінімум (min), максимум (max) та діапазон. На таблиці посилаються за необхідності, щоб доповнити обговорення наведених нижче рисунків.

Перенесення бактерій з інокульованої поверхні на їжу.

Перенесення E. aerogenes з TSB та прищеплених буфером поверхонь (плитка, нержавіюча сталь, дерево та килим) на продукти харчування (кавун, хліб, хліб з маслом та клейкі цукерки) з часом (рис. 1 та та 2, 2 Стовпчики помилок на рис. 1 і 22 показують стандартні відхилення записаних спостережень. Оскільки багато результатів сценарію були подібними, не всі спостереження будуть конкретно обговорюватися нижче.

Вплив часу контакту на логарифмічний відсоток переносу E. aerogenes, інокульованих на чотири побутові поверхні в матриці TSB до чотирьох харчових продуктів.

Вплив часу контакту на логарифмічний відсоток переносу E. aerogenes, інокульованого на чотири побутові поверхні в пептоновій буферній матриці, на чотири продукти.

Інокульована поверхня до кавуна.

Коли всі поверхні, щеплені TSB, контактували з кавуном, спостерігався високий ступінь переносу бактерій до кавуна (рис. 1). Середній log-відсоток переносу бактеріальних клітин, що містяться в інокулюмі TSB, з плитки на кавун був найвищим через 5 с, тобто 1,99 (97%) (рис. 1М; див. Таблицю S1 в додатковому матеріалі). Середній логарифмічний відсоток переносу бактерій з нержавіючої сталі становив від 1,96 (90%) до 1,97 (93%) (рис. 1N; таблиця S1). Загалом, не було суттєвої різниці в перенесенні бактерій з будь-якої поверхні на кавун у різний час контакту (рис. 1M до toP P).

Середні швидкості переходу на кавун та стандартні відхилення, пов’язані із засобами, однакові для нержавіючої сталі, плитки та дерева. Однак для перекладу з килима на кавун середні швидкості перенесення та стандартні відхилення значно відрізняються від одного щеплення до іншого.

Інокульована поверхня до хліба.

Коли хліб скидали на плитку, прищеплену TSB, нержавіючу сталь, дерево або килим, найвища швидкість перенесення з деревини спостерігалася через 30 с (рис. 1С), хоча значна різниця між перенесеннями з деревини за 30 і 300 с була не спостерігається. Середній log-відсоток переносу бактерій з нержавіючої сталі становив від -0,56 (0,3%) до 1,97 (93%) (рис. 1B; див. Таблицю S2 у додатковому матеріалі). Для хліба, скинутого на плитку, середній відсоток перекладу журналу коливався від -0,95 (0,1%) до 1,96 (92%) (рис. 1А; таблиця S2), а середній відсоток перекладу з деревини коливався від -0,64 (0,2%) до 1,97 (94%) (рис. 1С; таблиця S2). Середній відсотковий коефіцієнт переносу з килиму коливався від -0,87 (0,1%) до 0,58 (4%), що було нижче, ніж від інших трьох контактних поверхонь (рис. 1D; таблиця S2). На рис. 2А; див. таблицю S2 у додатковому матеріалі). Нержавіюча сталь мала найвищий середній log-відсоток переносу бактерій на хліб через 300 с, при 1,91 (80%) (рис. 2B; таблиця S2). Середній часовий відсоток переносу бактерій з деревини з часом становив від -0,91 (0,1%) до 1,89 (78%) (рис. 2C; таблиця S2), а бактерій з килиму - від -1,68 (0,02%) до - 0,79 (0,2%) (рис. 2D). Стандартне відхилення нержавіючої сталі, плитки та дерева було найбільшим на рис. 1). Коли хліб, змащений маслом, контактував із щепленою плиткою, середній log-процентний перенос бактерій збільшувався між -1,08 (0,08%) та 1,81 (65%) з рис. 1E; Таблиця S3). Середній log-відсоток переносу бактерій з нержавіючої сталі на хліб, змащений маслом, становив від -1,63 (0,02%) до 1,91 (82%) (рис. 1F; таблиця S3), а середній log-відсоток переносу з деревини на хліб, змащений маслом, був між - 1,18 (0,07%) та 1,81 (65%) (рис. 1G; таблиця S3). Килим переносить менше бактерій, ніж інші контактні поверхні, проте середній log-відсоток перенесення з часом все ще збільшувався з -1,15 (0,07%) до 0,9 (8%) (рис. 1Н; таблиця S3).

Інокульована поверхня до клейкої цукерки.

ОБГОВОРЕННЯ

Хоча тиск не був змінною в нашому дослідженні, він може зіграти роль у сприянні переносу бактерій. Кусумангінрум та ін. виявили, що більше переносу відбувалося при застосуванні легкого тиску (20 г/см 2), хоча різниці були незначними (.30,3-log відсоткової різниці передачі) (33). Мбіті та ін. використовували тиск 200 і 1000 г/см 2, з тертям та без нього, і виявили, що різниця в швидкості переносу також мала (різниця переносу ∼0,5-log відсотків при застосуванні тиску) (37). Дослідження D'Souza та співавт. показали, що зміни тиску в межах від ∼1 до 100 г/см 2 не впливали на перенос вірусу (38). Пізніші дослідження в тій же лабораторії показали більше перенесення при більш високих тисках (~ 100 г/см 2), ніж при менших тисках (~ 10 г/см 2), особливо коли посівний матеріал був більш сухим (39).

Наші дані чітко показують, що час контакту впливає на перенесення бактерій, оскільки більше бактерій переноситься довше. Рецензовані дослідження Доусона та ін. повідомили, що більший час контакту з їжею (5, 30 або 60 с) призвів до більшої передачі, але лише при більших термінах сушіння (≥8 год) (8), приблизно еквівалентних нашому часу висихання 5 годин. Нерецензовані дослідження в Університеті Іллінойсу щодо перенесення бактерій із плитки, щепленої загальним E. coli, на печиво та клейких ведмедів виявили, що бактеріальний перенос спостерігався у кишкової палички та S. aureus з килиму, дерева та плитки на тост, макарони, бісквіт та липкий солодкий при контакті 3–30 років. Вологі продукти харчування, які контактували із забрудненою деревиною та плиткою, демонстрували вищі показники переносу, а довший час збільшували перенесення між цими продуктами та поверхнями. Дослідження Астонського університету показує, що на перенесення з килима не впливав склад їжі та час контакту (29).