Багатосеротипний підхід уточнює регулятор білка А, що контролює катаболіт, у групі основних патогенів людини Стрептокок

Предмети

Анотація

Білок контролю катаболіту A (CcpA) є висококонсервативним головним регулятором використання джерела вуглецю у грампозитивних бактерій, але регулон CcpA залишається невизначеним. У цьому дослідженні ми мали на меті уточнити регулон CcpA, визначивши вплив CcpA-інактивації на вірулентність та транскриптом трьох різних серотипів основного людського патогену групи A Стрептокок (ГАЗ). Інактивація CcpA суттєво зменшила вірулентність ГАЗ у широкому спектрі моделей тварин, що відповідають вимогам, що відповідає ідеї, що CcpA є критичним для грампозитивного бактеріального патогенезу. Завдяки порівняльній транскриптоміці ми встановили, що регулятор ядра CcpA GAS збагачений висококонсервативними мотивами зв'язування CcpA (тобто. кре сайтів). І навпаки, специфічні для штаму відмінності в транскриптомі CcpA, мабуть, складаються з уражених вторинних мереж. Доопрацювання кре склад сайту шляхом аналізу основного регулону сприяв розробці модифікованого кре консенсус, який свідчить про покращення прогнозування цілей CcpA в інших медично значущих грампозитивних патогенів.

Вступ

Кілька досліджень продемонстрували зв'язок між CcpA та вірулентністю основних грампозитивних патогенів, таких як Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Золотистий стафілококк, Clostridium difficile, Bacillus anthracis і Enterococcus faecium 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. У світлі величезного тягаря грампозитивних бактеріальних інфекцій, CcpA є одним із найвпливовіших регуляторних білків, що модулюють ландшафт вірулентності патогенних бактерій 26. Незважаючи на те, що вони були широко досліджені протягом 20 років, залишаються численні критичні прогалини у знаннях щодо функції CcpA та її впливу на бактеріальний патогенез. Наприклад, хоча CcpA, як відомо, впливає на експресію

15% геномів численних видів бактерій, вплив прямого та опосередкованого CcpA-опосередкованого впливу на транскрипцію залишається незрозумілим 15,27. Подібним чином роль CcpA у грампозитивній бактеріальній вірулентності в основному вивчалася на моделях бактеріємії, які представляють лише частину видів інфекцій, які спричиняють бактерії, що містять CcpA 28. Потрібна додаткова інформація щодо внеску CcpA у грампозитивний бактеріальний патогенез, враховуючи потенційну роль осі CcpA- (HPr-Ser46-P) -HPrK/P як нової антимікробної мішені 29 .

Більшість знань щодо опосередкованих CcpA ефектів на експресію генів мали місце в авирулентах Bacillus subtilis що віддалено пов'язане з більшістю організмів, у яких роль CcpA у патогенезі встановлена 16,21,30,31. На відміну від групи А Стрептокок (GAS) викликає у людей широкий спектр інфекцій, для яких встановлені тваринні моделі 32, робиться менш вірулентним завдяки інактивації CcpA і тісно пов'язаний з іншими організмами, на інфекційність яких впливає делеція CcpA, такими як S. pneumoniae і Streptococcus suis 15,18. Таким чином, ГАЗ може бути використаний для оцінки природи регуляторного впливу CcpA на інфекційність грампозитивних патогенів. Раніше ми встановили, що інактивація CcpA у штамі GAS серотипу впливає на експресію

15% геному і зменшує летальність на моделі бактеріємічної інфекції. Існує> 140 різних М серотипів ГАЗ, і інактивація регуляторного білка може мати різно різні ефекти залежно від серотипу ГАЗ, що вивчається 33,34. Таким чином, ми прагнули вивчити CcpA-інактивацію в множинних серотипах GAS, щоб перевірити гіпотези про те, що вплив CcpA-інактивації на вірулентність GAS не залежить від серотипу і що порівняльна транскриптоміка штамів GAS, у яких відсутня CcpA, полегшить ідентифікацію основного регулятора CAS GcpA.

Результати і обговорення

CcpA делеція має специфічні для серотипу ефекти

Щоб покращити розуміння внеску CcpA у широку патофізіологію ГАЗ-інфекцій, ми прагнули проаналізувати функцію CcpA у штамів М-серотипу, які є провідними причинами ГАЗ-інфекцій і віддалено пов'язані на основі філогенезу цілого геному (рис. 1а) 36,37,38. Ми також використовували батьківські штами, які повністю послідовно відомі та не мають мутацій у двокомпонентній системі контролю вірулентності (CovRS), яка впливає на транскриптом CcpA, оскільки CovR та CcpA спільно регулюють численні гени GAS 39. Таким чином, ми вибрали штами MGAS2221 (M1), MGAS10870 (M3) та MGAS6180 (M28) для нашого дослідження 36,37,38. Послідовність білка CcpA у цих трьох штамів ідентична (дані не наведені). Інактивація CcpA в цих трьох фонах призвела до значного дефекту росту в багатому середовищі лише для штаму серотипу M3 MGAS10870 (рис. 1b). Хоча чому тільки MGAS10870ΔccpA штам показує дефект росту невідомий, що важливо, цей дефект росту відновлюється в ccpA-доповнений штам (рис. 1b), що пояснюється відсутністю ccpA як основна причина дефекту росту. Відповідно до попередніх спостережень щодо штамів серотипу M1, CcpA-інактивація зменшила розмір колонії у штаму MGAS10870 16,39. І навпаки, колонії MGAS6180 були рівномірно малими і на них не впливала втрата ccpA (Додаткова рис. S1).

Характеристика штамів серотипу GAS M та їх ccpA похідні.

(a) Філогенез цілого геному послідовних штамів GAS. Повні геноми GAS із зазначеними M серотипами (синього кольору) були отримані від NCBI. Взаємозв'язки були виведені з 68 084 основних однонуклеотидних локусів поліморфізму (SNP) за допомогою SplitsTree. Розташування батьківських штамів, використаних у цій роботі, позначено червоним кольором. (b) Криві зростання для дикого типу, ccpA-інактивовані та доповнені штами в THY. Точки даних - це середнє та стандартне відхилення від повторюваних зразків кожного штаму, виміряні двічі незалежно.

CcpA впливає на вірулентність ГАЗ у багатьох моделях зараження

Ефект від ccpA делеція на вірулентність штамів серотипу GAS на мишачих моделях інфекції.

Швейцарським мишам CD-1 інокулювали штами GAS внутрішньочеревно (a) або інтраназально (b) маршрут. Мишей спостерігали майже до смертності за моделлю бактеріємії (a) і виживання було зображено. Для ротоглоткової моделі (b), мазки з горла отримували щодня, і щільність бактерій проводили графіком. Значення P були отримані в результаті аналізу повторних вимірювань (див. Методи).

Використання мультисеротипового підходу для визначення основного регулятора ГПС CcpA

Ефект від ccpA видалення на транскриптомі ГАЗ.

(a) Лінійне представлення геному штамів серотипу GAS, що демонструє ефект ccpA-інактивація на експресії гена, зображена як зміна журналу. (b) Зважена діаграма Венна, що відображає розподіл та перекриття генів, уражених CcpA, у всіх трьох серотипах була сформована за допомогою програми BioVenn 60. Стрілки вказують на кількість генів, репресованих (вниз) і активованих (вгору) CcpA в окремих серотипах і в основному регулоні. (c) Гени, на які впливає CcpA у кожному серотипі, показано в порядку категорій COG. Кожне кольорове коло позначає збагачення певного COG у штамі серотипу. [C] Виробництво та перетворення енергії; [E] Амінокислотний транспорт та метаболізм; [G] Транспорт і метаболізм вуглеводів; [I] Транспорт ліпідів і метаболізм; [J] Переклад, рибосомна структура та біогенез; [L] Реплікація, рекомбінація та відновлення; [M] Біогенез клітинної стінки/мембрани/оболонки; [N] Рухливість клітин; [O] Посттрансляційна модифікація, білковий оборот, шаперони; [R] Тільки загальне передбачення функції; [S] Функція невідома; [U] Внутрішньоклітинний обіг, секреція та везикулярний транспорт.

Щоб краще зрозуміти функціональний вплив регулону CcpA на серотипи, ми призначили гени в кластер ортологічних груп (COG). П'ять COG послідовно збагачувались у всіх трьох серотипах, транспорт вуглеводів та метаболізм яких [G] містили найбільшу кількість генів (рис. 3в). Також повідомлялося, що два з цих COGS, G та S, домінують над генами, що зазнають впливу CcpA, в інших грампозитивних патогенах 20,27,31,42. Однак кілька COG, таких як M (біогенез клітинної стінки/мембрани/оболонки), R (лише загальне передбачення функції) та E (транспорт і метаболізм амінокислот), які раніше були визначені як частина регулону CcpA у інших видів 31, 42 були збагачені лише одним або двома із досліджених тут серотипів GAS, що припускає, що ці конкретні COG можуть бути частиною штамового регулону CcpA, а не основним аспектом фізіології CcpA.

Враховуючи критичний вплив CcpA на патогенез ГАЗ, ми визначили, як інактивація CcpA впливає на відомі рівні транскрипту гена вірулентності. Цікаво, що лише дев'ять генів оперону, що кодує цитолізин, стрептолізин S (sagA-sagI) 44, під впливом CcpA у кожному серотипі (додаткова фігура S5). CcpA-залежну серотип-специфічну варіацію спостерігали для IL-8, що розкладає Streptococcus pyogenes клітинна оболонка протеїназа (SpyCEP) та ендоглікозидаза, що розщеплює імуноглобулінS (EndoS) (додаткова фігура S5) 45,46. Промоутерські регіони spyCEP і endoS гени не містили чітких відмінностей, щоб врахувати серотип-специфічні відмінності. У сукупності ми робимо висновок, що мультисеротипний транскриптомний підхід дозволив пояснити основний регулон CcpA.

Функціональний кре сайти високо збережені в серотипах ГАЗ

Поширення кре і cre2 мотиви.

(a) Відсоток кре і cre2-що містять оперони, які виявляють CcpA-залежну диференціальну експресію (DE) або не (ні), у трьох штамах серотипу GAS. (b) Розподіл основних генів регулону на основі присутності (кре) або відсутність (не-кре) з кре сайт в промоутері. (c) Диференційно регульовані гени, що містять кре або cre2 оператори, що відображаються відносними відсотками, які подавляються (вгору) або активізуються (вниз) у ΔccpA. (d) Число кре і cre2 ділянки в ядрі ГАЗу CcpA регулон, зображені у вигляді діаграми Венна.

Порівняння кре і cre2 сайтів у регуляторі CcpA ГАЗ

Покращений ГАЗ кре мотив.

Представлення веб-логотипу ГАЗ кре мотив консенсусу. Частота зустрічальності нуклеотидів для всіх основних сайтів GAS cre порівнюється з частотою зустрічальності для B. subtilis 43. Позиції, що відображають помітні відмінності між S. pyogenes і B. subtilis позначені червоними рамками.

Прогнозування кре оператори інших грампозитивних збудників.

Люкс кре сайти, передбачені для (a) С. пневмонія і (b) S. aureus за допомогою креGAS та RegPrecise (RP) порівнюються та відображаються як діаграми Венна (дзвінки). База даних RegPrecise була доступна в листопаді 2015 року. Cre сайти, які повідомили про експериментальні докази експресії, залежної від CcpA, відображаються на нижній панелі (регульовані гени).

Висновки

У цьому документі ми застосували мультисеротипний підхід для уточнення основного регулятора CcpA GAS, який, як ми виявили, складається в основному з репресованих генів, на які, ймовірно, безпосередньо впливає CcpA з огляду на кре елементів. Потужність цього методу ілюструється тим, що лише 173 з 540 генів (32%), диференційовано регульованих у трьох серотипах, були уражені в усіх трьох штамах. Таким чином, наші дані свідчать про те, що багато раніше опублікованих транскриптомів CcpA, ймовірно, містять специфічні для штаму вторинні ефекти інактивації CcpA. Наш покращений креМотив ГАЗ, отриманий на основі даних про багатошарові транскриптоми, повинен сприяти підвищенню точності силіко прогнозування CcpA-регульованих генів у широкому спектрі патогенів.

Цікаво, що ми спостерігали, що значна частина регулону ядра CcpA (55%) не є-кре-підшипник. Це спостереження може свідчити про невиявлене, не-кре-заснований режим регулювання CcpA, такий як cre2 мотив, нещодавно запропонований в S. suis 42. Однак навіть включення cre2 мотив складав лише 15 додаткових генів в основному регулоні. Залишається можливим, що основних генів GAS CcpA регулон не вистачає кре або cre2 сайти є частиною транскрипційної регуляторної мережі регулятора, ураженого CcpA, враховуючи, що основний регулон CcpA включає принаймні два TCS, вісім автономних регуляторів та два білки транскрипційного антитермінатора (Додаткова таблиця S1).

Концепція метаболічних регуляторів як детермінант вірулентності підтверджується тим фактом, що здатність збудника процвітати вимагає здатності використовувати джерела їжі в хазяїні, що, в свою чергу, покладається на контроль метаболічних шляхів. Таким чином, подальше розуміння функції CcpA може допомогти у розробці нових профілактичних або терапевтичних стратегій, застосовних до численних грампозитивних патогенів.

Методи

Заява про етику

Експерименти на мишах проводились згідно з протоколами, затвердженими Інституційним комітетом з догляду та використання тварин MD Anderson (Номер протоколу: 00000808). Всі зусилля були зроблені, щоб мінімізувати страждання.

Штами бактерій, середовища та ріст

Усі штами, використані в цьому дослідженні, перераховані в таблиці S5. Група А Стрептокок (GAS) штами регулярно вирощували в середовищі Тодда-Хьюітта з додаванням 0,2% екстракту дріжджів (THY) при 37 ° C з 5% CO2. Левоміцетин (4 мкг/мл) та спектроміцин (150 мкг/мл) використовувались для відбору для CcpA-комплементуючих та CcpA-інактивуючих плазмід відповідно. Для отримання ізогенного застосовували неполярний інсерційний мутагенез ccpA мутанти в кожному із штамів серотипу, як описано раніше для MGAS2221 39. ccpA ген кожного штаму серотипу був використаний для створення їх відповідної CcpA-комплементуючої плазміди, як описано раніше 39, і введений у ці мутанти для генетичного доповнення. Мутанти та комплементовані штами були перевірені за допомогою Саузерн-блот та qRT-PCR ccpA і відомі CcpA-регульовані гени (дані не наведені), як описано раніше 50 .

Дослідження на тваринах

Для qRT-ПЛР у режимі реального часу Taqman штами вирощували у двох примірниках двічі до середньої експоненціальної фази в THY та обробляли, як описано раніше 50. Розшифровка генів відбувається між диким типом і ccpA-інактивоване похідне кожного штаму серотипу порівнювали за допомогою звичайного одностороннього ANOVA. Застосовані праймери та зонди наведені в таблиці S5.

Силіко Ідентифікація регулона CcpA

Прогнозували регулон CcpA in silico використання класичної імовірнісної матричної вагової стратегії 57. Коротко, ми розглядали оперон як скупчення генів, що кодують в одному напрямку з менше ніж 50 пар основ між ними 58. Ми створили дві незалежні матриці консенсусної ваги сайту зв'язування CcpA згідно з раніше повідомленими даними 42,43. За допомогою алгоритму MAST 59 кожна з матриць була використана для скринінгу 150 bp перед потоком та 50 bp за течією кожного оперона, що міститься у штамах MGAS2221, MGAS6180 та MGAS 10870 S. pyogenes геноми. Нарешті, ми прийняли лише ті прогнози сайту зв'язування CcpA, які мали подібність вище 70% із відповідною матрицею консенсусу. Використовуючи передбачені послідовності сайтів зв'язування CcpA, збережені в основному регулоні, ми створили нову матрицю консенсусу, креГАЗ і обстежений повний геном S. pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) та S. aureus Ньюман (NC_009641.1).

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: DebRoy, S. та ін. Багатосеротипний підхід уточнює регулятор білка А, що контролює катаболіт, у групі основних патогенів людини Стрептокок. Наук. Респ. 6, 32442; doi: 10.1038/srep32442 (2016).