Аналіз молекулярної дієти личинок Anguilliformes leptocephalus, зібраних у західній частині північної частини Тихого океану

Ролі Концептуалізація, курація даних, формальний аналіз, розслідування, методологія, адміністрування проектів, ресурси, перевірка, візуалізація, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Національний науково-дослідний інститут рибного господарства, Японське агентство рибних досліджень та освіти, Канадзава, Йокогама, Японія

Ролі Концептуалізація, дослідження, методологія, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Національний науково-дослідний інститут рибного господарства, Японське агентство рибних досліджень та освіти, Канадзава, Йокогама, Японія, Інститут досліджень цивільного будівництва для холодного регіону, Науково-дослідний інститут громадських робіт, Саппоро, Хоккайдо, Японія

Ролі Курація даних, ресурси, написання - огляд та редагування

Філія Національний науково-дослідний інститут рибного господарства, Японське агентство рибних досліджень та освіти, Канадзава, Йокогама, Японія

Ролі Придбання фінансування, адміністрування проекту

Ролі Вимірювання даних, Формальний аналіз, Розслідування

Дослідження ролей, ресурси

Інститут досліджень аквакультури філій, Університет Кіндай, Хігасімуро, Вакаяма, Японія

Ролі Придбання фінансування, розслідування, адміністрування проекту

Філія Tohoku Національний інститут досліджень рибного господарства, Японське агентство з досліджень та освіти в галузі рибного господарства, Shiogama, Miyagi, Японія

Ролі Збір даних, Формальний аналіз

Афіліація RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Цурумі, Йокогама, Японія

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Написання - огляд та редагування

Афіліація RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Цурумі, Йокогама, Японія

Дослідження ролей, написання - огляд та редагування

Станція Shibushi, Національний науково-дослідний інститут аквакультури, Японське агентство з досліджень та освіти рибного господарства, Shibushi, Кагосіма, Японія

Ролі Збір даних, Формальний аналіз, Перевірка, Візуалізація, Написання - огляд та редагування

Сейнен Чау,
Нобухару Інаба,
Сатоші Нагай,
Хіроакі Курогі,
Йодзі Накамура,
Такаші Янагімото,
Хідекі Танака,
Дайсуке Хасегава,
Тайга Асакура,
Джун Кікучі

Цифри

Анотація

Цитування: Chow S, Inaba N, Nagai S, Kurogi H, Nakamura Y, Yanagimoto T, et al. (2019) Аналіз молекулярної дієти личинок Anguilliformes leptocephalus, зібраних у західній частині північної частини Тихого океану. PLoS ONE 14 (11): e0225610. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225610

Редактор: Рейчел С. Порецький, Університет Іллінойсу в Чикаго, США

Отримано: 10 липня 2019 р .; Прийнято: 7 листопада 2019 р .; Опубліковано: 27 листопада 2019 р

Наявність даних: Усі дані послідовності доступні за LC439371 ‒ LC439410, LC464077 ‒ LC464098, LC474264 ‒ LC474368.

Фінансування: Ця робота була підтримана грантами від проекту Інституту прогресу досліджень біоорієнтованих технологій, NARO (проект спеціальної схеми передових досліджень та розробок для технологій наступного покоління) для DH.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Нещодавно для визначення вмісту кишечника лептоцефалів використовуються молекулярні аналізи. Незважаючи на те, що послідовності 18S рДНК у найрізноманітніших організмів планктону були виявлені в кишці лептоцефалів європейського вугра (A. anguilla), головним раціоном підозрювали драглистий зоопланктон (гідрозойні медузи) [12]. Однак у зразках кишечника лептоцефалів японського вугра жодної рибосомальної ДНК тваринного походження (внутрішній транскрибований спейсер 1) не виявлено, а в раціоні підозрювали вже деградований матеріал [13]. Нещодавно було застосовано більш досконалий метагеномічний аналіз із використанням послідовності наступного покоління (NGS), який показав, що 76% зчитувань рДНК 18S, виявлених із кишечника лептоцефалуса європейського вугра, належить до типу Cnidaria [14]. Однак споживання медуз-медоносів суперечить результатам аналізу стабільного ізотопу, за яким, як повідомляється, трофічні позиції лептоцефалів є низькими [6,15–19]. Невід’ємною проблемою попередніх молекулярних досліджень [12–14] є те, що жоден зразок з поверхні тіла лептоцефалів не аналізувався, що могло б стати основним джерелом перехресного забруднення.

Ми провели метагеномний аналіз на основі 18S рДНК, використовуючи NGS не тільки для зразків вмісту кишечника, але також для зразків вискоблювання поверхні тіла лептоцефалів, в яких кнідаріальні 18S рДНК в зразках, що вискоблюють поверхню тіла, переважали над аналізами у зразках вмісту кишечника.

Матеріали і методи

Заява про етику

Зразки личинок, захоплені планктонними сітками, розгорнутими з дослідницьких суден, були мертві під час вилучення та відбирали проби в цей час, і всі операції з сіткою планктону проводились у відкритому морі за межами ексклюзивної економічної зони. Отже, затвердження прибережних держав не вимагалося згідно з Конвенцією ООН з морського права (UNCLOS).

Вибірка та ідентифікація лептоцефалів

Пептидне нуклеотидна кислота (PNA) спрямована на ПЛР-затискання

Ми застосували ПНК-спрямоване затискання ПЛР для селективного пригнічення ампліфікації рДНК-хазяїна 18S [13,22]. Зонд PNA був розроблений для відпалу до послідовності поблизу 5 ’області в гені 18S рРНК, а послідовністю нуклеотидів була NH2-ACGGCCGGTACAGTG-CONH2, що має 80,7 ° C Tm. Універсальність пари праймерів для згаданої вище рДНК 18S була перевірена з використанням широкого спектру еукаріотів: японського вугра (A. japonica), японського бухаря (Takifugu rubripes), японського саджанця (Sardinops melanostictus), широкосмугового колючого горіха (Sebastolobus macrochir), Тихий океан синього тунця (Thunnus orientalis), прісноводних креветок (Palaemon paucidens), омара колючого омара (Panulirus penicillatus), морського їжака з довгими колючками (Diadema setosum), бурих водоростей (Sargassum horneri і Petalonia binghamiae d) (Ceratoperidinium falcatum), в якому спостерігалося посилення очікуваного розміру фрагмента (приблизно 550 п.н.) у всіх видів. Ефективність затискання ПЛР тестували, додаючи 1 мкл ПНА (10 мкМ) до 25 мкл реакційної суміші ПЛР, використовуючи зразки еукаріотів, згадані вище. Ефективне затискання спостерігалось у японського вугра, широкосмугостого тернистого голови та тихоокеанського синього тунця, тоді як у інших організмів явного пригнічення ампліфікації не спостерігалося.

Генетичний аналіз зразків GC та BSS лептоцефалів

Вбудований контроль ДНК PhiX змішували з об'єднаною бібліотекою ДНК для поліпшення якості даних зразків з низьким розмаїттям, таких як одиночні амплікони ПЛР. Концентрації ДНК у об’єднаній бібліотеці та ДНК PhiX регулювали до 4 нМ, використовуючи буфер EB (10 мМ Tris-HCl рН 8,5), змішаний у співвідношенні 7: 3,5 мкл. Бібліотеку 4 нМ денатурували 5 мкл свіжого 0,1 N NaOH. Використовуючи буфер HT1 (наданий набором реагентів Illumina MiSeq v. 2 для 2 × 150 bp PE), денатуровану бібліотеку (10 мкл; 2 нМ) розбавляли до кінцевої концентрації 12 pM для секвенування на платформі MiSeq.

Процеси обробки даних MPSS та збір оперативних таксономічних одиниць

Нуклеотидні послідовності демультиплексували на основі тегу 5′-мультиплексного ідентифікатора (MID) та послідовностей праймерів, використовуючи формат за замовчуванням у MiSeq. Послідовності, що містять кліпси паліндрому довжиною більше 30 п.о. та гомополімер довше 9 п.н., обрізали з послідовностей на обох кінцях. Хвости 3 ’із середнім показником якості менше 30 наприкінці останнього вікна 25 п.о. також обрізали з кожної послідовності. Хвости 5 'і 3' із середнім показником якості в Таблиці 1. Підсумок зразків лептоцефалу, зібраних у 2017 році та використаних у цьому дослідженні.

Огляд еукаріотичних груп у зразках GC та BSS

Зразок ГХ отримували з 36 лептоцефалів, оскільки видавлення ГХ не вдалося виконати у чотирьох зразках (табл. 1). Зразок BSS відбирали з 17 лептоцефалів (табл. 1). З ОТУ, отриманих після перевірки якості послідовностей 18S рДНК, ті, що мають низьку схожість (Таблиця 2. Підсумок еукаріотичних груп, виявлених у вмісті кишечника (GC) та зразках поверхні тіла (BSS) зразків лептоцефалів вугра, а також кількості OTU та зчитувань 18S рДНК.

Вісім еукаріотичних груп, виявлені у зразках GC, включали 75 OTU та 103464 зчитування, а сім еукаріотичних груп, виявлені у зразках BSS, включали 64 OTU та 97612 зчитування (таблиця 2, рис. 1A та 1B). Медузи були основним компонентом обох зразків, займаючи 33,0% від загальної кількості зразків у ГХ та 67,5% у зразках БСС. Коноїдний паразит був другим за поширеністю (23,8%) у зразку GC, але нульовим у зразку BSS. Менш частими еукаріотичними групами у зразках GC та BSS були тунікати (10,1% та 14,0% відповідно), копеподи (11,1% та 2,7%), криль (3,9% та 7,9%), анеліди (Рис. 1. Склад восьми еукаріотичних групи (див. таблицю 2), виявлені у зразках поверхні кишечника та тіла Anguilliformes leptocephali.

(А) Огляд восьми еукаріотичних груп у зразках кишечника (n = 35). (B) Огляд семи еукаріотичних груп у зразках поверхні тіла (n = 16). (C) Склад восьми еукаріотичних груп у кожній лептоцефалії.

Еукаріотичні композиції в кожному зразку

Склад еукаріотів значно варіювався серед особин лептоцефалії (рис. 1С). Індекс різноманітності Шеннона-Вінера коливався від 0 до 0,814 у зразках GC та від 0 до 0,699 у зразках BSS без суттєвої різниці між зразками (тест Манна ‒ Уітні, p = 0,578), але неоднорідність між GC і BSS зразки, згадані вище, також мали місце на індивідуальному рівні (рис. 1С). Систематична різниця в еукаріотичних композиціях між зразками GC та BSS була проілюстрована за допомогою аналізу PCA (рис. 2). Зразки ГХ були розподілені незалежно від видів (рис. 2, чорні символи). З іншого боку, зразки BSS були тісно пов’язані між собою (рис. 2, жовті символи), за винятком трьох викидів (рис. 2, стрілка), у яких не спостерігалося зчитування медуз у цих трьох зразках BSS (див. Також рис. 1C, Aj -664S, Am-612S та SR-614S).

Аналіз основних компонентів еукаріотичних композицій рДНК 18S у вмісті кишечника (чорні символи) та зразки вискоблювання поверхні тіла (жовті символи). Кола (Anguilla japonica та A. marmorata), трикутники (Gymnothorax spp.), Алмази (Robinsia sp.) Та квадрати (інші види). Стрілки вказують на три викиди у зразках, що вискоблюють поверхню тіла, які не мають зчитування кнідаріана.

Зчитування медуз було виявлено у 18 із 35 зразків GC та 13 з 16 зразків BSS зі значною різницею (точний тест Фішера, p = 0,040), а стандартизований показник зчитування медуз був більшим у зразках BSS, ніж у зразках GC (Mann –Тест Уітні, p Рис. 3. Склад таксонів медуз, що знаходяться в кишках (G) та зішкріб поверхні тіла (B) зразків 13 лептоцефалів, що мають як зразки G, так і B.

Кількість прочитаних послідовностей у вибірці перетворювались на відносну кількість читань на мільйон читань.